芽孢杆菌所产挥发性物质对黄曲霉的抑制作用研究

摘要

利用拮抗菌来防治黄曲霉及其毒素的污染已成为国内外学者近年来研究的热点。通过微生物之间的拮抗作用来控制粮食中的黄曲霉具有安全、高效、环保的优点。芽孢杆菌产生的挥发性代谢物具有良好的抗霉性能，同时具有分子量低、易通过空气快速扩散的特点，在粮食储藏防霉方面存在应用价值。本论文首先对产抗霉活性挥发性物质的芽孢杆菌菌株进行了筛选、鉴定，进而对其产挥发性物质的发酵工艺进行优化研究以提高抗霉效果，并对挥发性物质进行成分鉴定与抗霉作用机理探讨，最后研究了挥发性物质对稻谷的防霉效果。旨在为开发新型的稻谷防霉熏蒸剂提供理论依据。研究的主要结果如下: 从多种材料中分离得到4株芽孢杆菌，通过平板对扣法分别测定了它们对黄曲霉的抑霉率。结果表明，4株芽孢杆菌中的R2菌株对黄曲霉的抑霉率最高，为73％。对菌株R2进行了形态学、生理生化鉴定以及16S rDNA鉴定，最终确定菌株R2为蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)。 在基础培养基的基础上，通过单因素试验和正交试验对菌株R2产抗霉活性挥发性物质的固态发酵工艺进行了优化。确定了该菌株最佳发酵温度为32℃，最佳初始pH值为7.0。确定了培养基的最佳配方为:可溶性淀粉20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl10 g/L，Na2HPO41 g/L和MgSO40.4 g/L。在最佳固态发酵工艺下，菌株R2对黄曲霉的抑霉率达到85.2％，比优化前提高了16.7％。 通过研究挥发性物质对黄曲霉孢子萌发、菌丝生长、菌丝形态结构及黄曲霉色素合成的影响，初步探讨了挥发性物质的抗霉作用机理。在挥发性物质存在的条件下，黄曲霉孢子萌发及菌丝生长受到明显抑制。光学显微镜和扫描电子显微镜观察结果表明，挥发性代谢物会造成黄曲霉菌丝形态异常，主要表现为菌丝扭曲、异常粘连，菌丝表面发生塌陷，且不能形成分生孢子。菌株R2产生的挥发性物质能够完全抑制黄曲霉在生长过程中的色素合成。对菌株R2产生的挥发性物质进行顶空固相微萃取—气质联用分析(SPME-GC-MS)，鉴定出18种不同的组分，这些物质主要为烷烃、醇、醛和酯类物质。 将接种了黄曲霉孢子的稻谷与菌株R2共同培养在密闭的三角瓶中，研究菌株R2所产的挥发性物质对稻谷霉变及黄曲霉毒素的防控效果。分别对培养了3、5、7d的处理组和对照组稻谷的霉菌数、AFTB1含量、脂肪酸值进行了检测。结果表明，菌株R2所产挥发性物质不仅能有效抑制稻谷中霉菌数的增长，对控制稻谷中AFTB1含量和稻谷的脂肪酸值也具有显著效果。说明该挥发性物质具有进一步被开发为稻谷储藏防霉熏蒸剂的研究价值。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 黄曲霉及其毒素危害

1．1．1 黄曲霉

1．1．2 黄曲霉毒素

1．2 黄曲霉及其毒素防治方法

1．2．1 收获前的控制策略

1．2．2 收获后的防治措施

1．3 微生物挥发性物质

1．3．1 微生物挥发性物质的功能

1．3．2 微生物挥发性物质的成分组成及测定方法

1．4 芽孢杆菌及其挥发性物质

1．4．1 芽孢杆菌概述

1．4．2 芽孢杆菌挥发性活性物质研究进展

1．5 本论文研究的目的及意义

1．6 研究的主要内容与技术路线

2 产抗霉活性挥发性物质芽孢杆菌的筛选与鉴定

2．1 试验材料与仪器

2．1．1 试验材料

2．1．2 主要仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．1 芽孢杆菌的分离与筛选方法

2．2．2 形态鉴定方法

2．2．3 生理生化鉴定方法

2．2．4 16S rDNA序列测定方法

2．3 结果与分析

2．3．1 菌株的分离与筛选

2．3．2 形态鉴定

2．3．3 生理生化鉴定

2．3．4 16S rDNA序列测定

2．4 本章小结

3 芽孢杆菌产抗霉活性挥发性物质的发酵工艺优化

3．1 试验材料与仪器

3．1．1 试验材料

3．1．2 主要仪器与设备

3．2 试验方法

3．2．1 抑霉活性检测方法

3．2．2 固态发酵工艺优化方法

3．3 结果与分析

3．3．1 培养条件优化结果

3．3．2 培养基优化结果

3．4 本章小结

4 挥发性抗霉活性物质抑菌机制研究及成分鉴定

4．1 试验材料与仪器

4．1．1 试验材料

4．1．2 主要仪器设备

4．2 试验方法

4．2．1 菌液及菌丝团的制备方法

4．2．2 挥发性物质抗霉作用机理研究方法

4．2．3 挥发性代谢物质的成分鉴定方法

4．3 结果与分析

4．3．1 挥发性物质对菌丝生长及色素合成的影响

4．3．2 挥发性物质对孢子萌发的影响

4．3．3 挥发性物质对菌丝形态的影响

4．3．4 挥发性代谢物质的成分组成

4．4 本章小结

5 挥发性物质对稻谷防霉效果研究

5．1 试验材料与仪器

5．1．1 主要材料

5．1．2 培养基与主要试剂

5．1．3 主要仪器设备

5．2 试验方法

5．2．1 菌液制备方法

5．2．2 挥发性物质对稻谷霉变的整体防控效果测定方法

5．2．3 挥发性物质对稻谷中霉菌数的控制效果测定方法

5．2．4 挥发性物质对稻谷脂肪酸值的控制效果测定方法

5．2．5 挥发性物质对稻谷中AFTB1的控制效果测定方法

5．3 结果与分析

5．3．1 挥发性物质对稻谷霉变的整体防控效果

5．3．2 挥发性物质对稻谷中霉菌数的控制效果

5．3．3 挥发性物质对稻谷中AFTB1的控制效果

5．3．4 挥发性物质对稻谷脂肪酸值的控制效果

5．4 本章小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

6．3 论文创新点

参考文献

致谢