一种产黄曲霉素B1降解酶的枯草芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一种产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌株。本发明所提供的产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HDR‑02，它在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2016298，其16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。实验证明，本发明所提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HDR‑02对黄曲霉毒素B1脱毒能力强，作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，对饲料的感官品质没有影响；同时，枯草芽孢杆菌HDR‑02繁殖速度快、环境耐受力强，能促进动物的健康生长、提高动物的生产性能，适用于畜牧业生产中。

说明书

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素技术领域，具体涉及一种产黄曲霉素B1降解酶的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，黄曲霉毒素是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。其中，毒性最强、危害最大的为黄曲霉毒素B1，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，被列入严管的特剧毒物质，0.294毫克/公斤剂量的黄曲霉毒素B1，就能引起敏感动物的急性中毒死亡。黄曲霉毒素也是一种强致癌物，黄曲霉毒素B1的致癌能力，是二甲基硝胺的70倍。据在我国肝癌高发区的调查发现，肝癌的高发与吃了被黄曲霉毒素污染的粮食有关。

黄曲霉毒素B1污染范围广且具有很强的毒性作用，严重危害到人类和动物健康，采取有效的脱毒措施成为亟须解决的问题，饲料原料从田间生长到收获、贮存、运输及加工处理等各个环节中，由于生产管理或者环境条件不当，都有可能会被霉菌或者霉菌毒素污染，动物饲料中玉米、花生饼、棉籽饼、豆粕等黄曲霉毒素的含量常常超过国家《饲料卫生标准》的最高限量。传统的物理、化学脱毒方法均存在破坏饲料的营养成分，影响饲料的品质等缺陷。生物法为黄曲霉毒素B1的脱毒提供新的发展方向，但筛选出的微生物及代谢产物安全性存在质疑，会给动物机体造成额外的损伤，难以在实际生产中广泛应用。因此利用益生菌及其制剂来脱除饲料中的AFB1具有广泛的应用前景，是未来研究的热点。

发明内容

为了克服现有技术的上述不足，本发明提供了一种产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌，以及该菌株在黄曲霉毒素B1脱毒中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种产黄曲霉B1降解酶的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌在2016年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武汉大学内)，其提议的分类命名为枯草芽孢杆菌HDR-02，保藏编号为CCTCCNO：M2016298。

进一步地，所述的产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌的16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述的产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌在黄曲霉毒素B1脱毒中的应用也属于本发明的保护范围。体外试验表明枯草芽孢杆菌HDR-02对黄曲霉毒素B1有很好的脱毒能力，脱毒24小时，可脱除75.7％的黄曲霉毒素B1。

进一步地，所述产黄曲霉毒素B1降解酶的枯草芽孢杆菌是应用于动物体内黄曲霉毒素B1脱毒。

进一步地，所述动物包括鸭、鸡、猪、反刍动物以及毛皮动物。

一种用于动物体内黄曲霉毒素B1脱毒的菌剂，它的活性成份为所述的产黄曲霉B1降解酶的枯草芽孢杆菌HDR-02。以所述的产黄曲霉B1降解酶的枯草芽孢杆菌HDR-02为活性成份的动物体内黄曲霉毒素B1脱毒菌剂，可作为饲料添加剂添加到养殖动物的饮水或饲料中，在进入动物肠道后，枯草芽孢杆菌HDR-02迅速活化、增殖并且同时在肠道微生态环境中形成有益优势菌群，能促进动物生长，降低黄曲霉毒素B1对动物的毒性，缓解黄曲霉毒素B1对动物肝脏的损伤。

本发明的有益效果：(1)本发明所述的枯草芽孢杆菌HDR-02对黄曲霉毒素B1脱毒能力强，作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，对饲料的感官品质没有影响；(2)本发明所述的枯草芽孢杆菌HDR-02繁殖速度快、环境耐受力强，能促进动物的健康生长、提高动物的生产性能，适用于畜牧业生产中。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌HDR-02的生长曲线图；

图2为枯草芽孢杆菌HDR-02以及黄曲霉毒素B1对雏鸭肝脏组织结构的影响示意图。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

实施例1：枯草芽孢杆菌HDR-02采集、分离和初筛

1、菌株的采集、分离

样品取自90日龄健康肉鸡鸡粪和霉变谷物。样品采集后，放入装有3mL无菌水的7mL EP管中，于80℃水浴10min后LB活化培养基中划线培养，37℃、24h培养后，选取白色而有光泽、表面湿润、平坦、边缘整齐、1mm左右大小的菌落，挑取疑似菌落做纯培养。

纯培养的菌落经菌落形态的观察、革兰氏染色进行筛选，细菌呈长杆状，单个、成对或链状排列的革兰氏阳性杆菌均传代保存。

2、菌株的初筛

将分离菌株接于混有香豆素溶液的改良初筛培养基中，保证香豆素成为唯一碳源和能源，将其置于37℃培养箱中培养一周，观察菌株的生长情况。为避免细菌在原环境中的碳源干扰，挑取有生长现象的菌株，连续三次以同样方法进行培养，最后保存那些能在以香豆素为唯一碳源的培养基上生长的菌株。

其中，10％香豆素溶液：1g香豆素溶于10mL无菌水单独配成溶液，过滤灭菌。香豆素不溶于水，采用微热方式使其在水中融化，并迅速用0.22μm无菌过滤器过滤。

固体初筛培养基：(NH₄)₂SO₄2.0g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄·H₂O>20.1g，琼脂15g，蒸馏水990mL，pH＝7.0，121℃灭菌15min，稍冷后加入10mL10％香豆素溶液并混匀。

3、黄曲霉毒素B₁纯品脱毒复筛：

分别取初筛分离菌株的发酵液950μL，各加入50μL的AFB₁标准工作液(1ppm)，在37℃、200r/min条件下反应24小时，以等量的LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌15min)。加等量的黄曲霉毒素B₁标准工作液为对照，采用黄曲霉毒素B₁酶联免疫定量测试盒对其进行毒素测定及脱毒率的分析。

结论：通过黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒对脱毒率的分析，反应24小时后对黄曲霉毒素B1脱毒率最高的三种菌株初步命名为HDR-02、HDR-21、HDR-30，脱毒率分别为75.7％、65.7％和41.4％。

4、生物学特性的复筛

1)生长曲线的测定：挑取上述HDR-02、HDR-21、HDR-30菌株发酵，将菌株HDR-02、HDR-21、HDR-30发酵液以1％的接种量接种到5mL的LB液体培养基中，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h时将培养液取出，将培养液10倍梯度稀释后用倾注法测菌株的生长曲线，每组试验做三个重复。以培养时间为横坐标，log(CFU/mL)值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线(见图1)。

结论：HDR-02、HDR-21、HDR-30中HDR-02的适应期最短、繁殖速度最快，可在2小时内进入对数期。

2)高温耐受性测定：取步骤1)中挑选保存好的HDR-02芽孢悬液注入到离心管中，采用10倍梯度稀释，用倾注法测剩余活菌数。再将装有剩余芽孢悬液的离心管分别置于75℃、80℃、85℃、90℃水浴锅中热处理5min，取热处理后的菌液进行逐级10倍梯度稀释，用倾注法测剩余活菌数。以等量的芽孢悬液加等量的生理盐水为对照，每组试验做三个重复，HDR-02芽孢高温耐受性结果见表1。

表1枯草芽孢杆菌HDR-02芽孢高温耐受性

处理温度75℃80℃85℃90℃存活率97.9±4.8％96.6±3.9％95.8±1.8％61.5±2.6％

3)模拟胃液耐受性测定：取0.5mL的HDR-02芽孢悬液加入到4.5mL的模拟胃液中(pH值为2.0)，并迅速在振荡器上充分混和，然后置于37℃培养箱静置培养。分别在0h、2h和4h的时候取出培养液并立即进行逐级10倍梯度稀释，用倾注法测剩余活菌数。以等量的芽孢悬液加等量的生理盐水为对照，每组试验做三个重复，枯草芽孢杆菌HDR-02芽孢高温耐受性结果见表2。

表2枯草芽孢杆菌HDR-02芽孢模拟胃液耐受性

处理时间2小时4小时存活率98.1±1.9％94.5±5.9％

4)模拟胆盐耐受性测定：取0.5mL的HDR-02芽孢悬液加入到4.5mL的0.3％模拟胆盐中(pH值为8.0)，并迅速在振荡器上充分混和，然后置于37℃培养箱静置培养。分别在0h、24h的时候取出培养液并立即进行逐级10倍梯度稀释，用倾注法测剩余活菌数。以等量的芽孢悬液加等量的生理盐水为对照，每组试验做三个重复。HDR-02芽孢在模拟胆盐中反应24小时后有92.4±5.4％的存活率。

结论：试验表明，菌株HDR-02具有较强的黄曲霉毒素B₁脱毒能力，脱毒率达到75.7％，同时还具有繁殖速度快、耐受力强的优点。

实施案例2：HDR-02菌株的鉴定

1、形态学鉴定及理化特征鉴定

上述HDR-02菌株的细胞形态和理化特征见表3。

表3 HDR-02菌株的细胞形态和理化特征

鉴定指标结果鉴定指标结果菌落颜色白色或微黄葡萄糖产酸+革兰氏染色阳性木糖产酸+细胞形态杆状阿拉伯糖产酸+芽孢+甘露醇产酸+接触酶+利用丙酸盐—水解明胶+硝酸盐还原+形成吲哚—水解淀粉+厌氧生长—7％氯化钠生长+

2、分子鉴定

通过菌株16SrRNA序列对菌株HDR-02进行种属鉴定。芽孢杆菌16SrRNA基因组PCR扩增所用引物为F1和R1(序列如下)。PCR扩增反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃最后延伸10min。扩增后，产物送至上海生工生物工程有限公司测序，菌株HDR-02的16S rRNA测序结果如SEQ ID No.1所示。

F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

R1：5’-AAGGAGGTGATCCACCC-3’

HDR-02的16SrRNA序列在NCBI进行Blastn比较，检索发现，HDR-02与Genebank中枯草芽孢杆菌序列同源性较高，相似性为99％(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，证明菌株HDR-02为枯草芽孢杆菌，正式命名为枯草芽孢杆菌HDR-02。

通过以上鉴定结果，确定实施例1所得的菌株HDR-02为产黄曲霉B1降解酶的枯草芽孢杆菌，并于2016年5月31日送交湖北省武汉市武汉大学内中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为：CCTCC NO：M2016298。

实施案例3：枯草芽孢杆菌HDR-02在雏鸭体内的应用

1日龄樱桃谷肉鸭，基础日粮预饲3天后，随机选取健康、体重相近的雏鸭，随机分为4个组，每组4个重复，每个重复5只雏鸭。具体分组如下：空白对照组、枯草芽孢杆菌HDR-02组、黄曲霉毒素B₁攻毒组、黄曲霉毒素B₁攻毒+枯草芽孢杆菌HDR-02组。其中黄曲霉毒素B1攻毒量为0.1mg/kg·BW，枯草芽孢杆菌HDR-02加菌量为每天10⁸CFU/mL，枯草芽孢杆菌HDR-02以灌胃方式加入，连续灌胃1周。

试验结果：灌服HDR-02能显著提高未攻毒组雏鸭的平均日增重，黄曲霉毒素B₁攻毒使雏鸭平均日增重显著降低，甚至引起雏鸭死亡；灌服HDR-02菌悬液能缓解黄曲霉毒素B₁中毒的影响(见表4)。灌服HDR-02不损伤雏鸭的肝脏，黄曲霉毒素B₁攻毒组雏鸭肝脏损伤严重，而HDR-02的添加可以显著缓解黄曲霉毒素B₁对雏鸭肝脏的损伤(见表5和图2)。

表4枯草芽孢杆菌HDR-02和黄曲霉毒素B₁对雏鸭平均日增重的影响

表5枯草芽孢杆菌HDR-02和黄曲霉毒素B₁对雏鸭血清生化指标的影响

组别ALT(U/L)AST(U/L)ALB/GLO空白组37.72±2.69^a34.16±13.5^a0.420±0.12益生菌组36.36±11.820.28±9.360.587±0.50益生菌+攻毒组61.42±12.4^a58.76±21.2^a0.298±0.17攻毒组95.72±6.65^b117.9±47.2^b0.235±0.15

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种产黄曲霉素B1降解酶的枯草芽孢杆菌及其应用

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gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg 180

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tgccctttgt tctgtccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat 360

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