定位于染色体7q31-32脑组织相对特异表达新基因LRRC4的克隆和功能初步研究

摘要

肿瘤的发生是历经多阶段,多因素参与的过程.其中,染色体的改变是肿瘤发生发展中的共同事件.大量研究证据表明7号染色体长臂与多种肿瘤密切相关.7q31-32区域多个位点的等位基因杂合性丢失（loss of heterozygosity,LOH）在恶性骨髓疾病、头颈部肿瘤、原发性乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃肠道肿瘤、胰腺癌和肾细胞癌中频繁出现.而功能研究出发现：将人类完整的7号染色体导入已丢失7q31-32区域的永生化人类成纤维细胞株后,这些细胞出现了终末分化的特性.这些实验提示染色体7q31-32区域存在一个或多个抑瘤基因.在前期的研究工作中,我们获得了一个定位于7q31-32的198kb的“工作草图”序列（AC008039),运用多种生物信息学方法对该序列进行详细的分析发现其中存在未被克隆的新基因.因此,我们拟在该序列的基础上克隆染色体7q31-32区域的新基因,并探讨其与肿瘤的关系.包括：第一部分：7q31-32区域脑瘤相关新基因LRRC4的克隆;第二部分：LRRC4编码蛋白的初步研究：序列分析和融合蛋白表达;第三部分：LRRC4在正常组织和肿瘤组织的表达研究.

目录

缩写词简表

ABSTRACT

前言

技术路线图

材料与方法

一、材料

1.组织与细胞

2.动物

3.菌株和质粒载体

4.试剂

5.主要仪器

二、方法

1.生物信息学分析

2.质粒DNA的提取

3.DNA序列测定

4.基因组DNA抽提

5.RACE反应

6.RNA的抽提

7.差异RT-PCR

8.Northern杂交

9.Southern杂交

10.甲基化检测

11.原位杂交

12.PCR-SSCP检测LRRC4基因编码区的点突变

13.LRRC4全长编码区克隆的构建

14.LRRC4蛋白的亚细胞定位

15.GST/LRRC4融合蛋白的原核表达

16.稳定表达LRRC4的U251细胞株的构建

17.细胞计数及绘制生长曲线

18.软琼脂集落形成试验

19.裸鼠接种实验

20.流式细胞仪检测细胞周期分布

结 果

第一部分7q31-32区域脑瘤相关新基因LRRC4的克隆

一、人LRRC4基因的克隆

二、人LRRC4基因编码区全长克隆的构建

三、小鼠LRRC4基因的克隆

第二部分LRRC4基因编码蛋白质及其特征研究

一、生物信息学分析LRRC4基因编码蛋白

二、LRRC4蛋白在哺乳动物活细胞中的定位

三、LRRC4融合蛋白在大肠杆菌中的表达与检测

第三部分LRRC4基因表达及其调控研究

一、LRRC4基因在正常组织的表达谱

二、LRRC4在多种原发性脑肿瘤中的表达

三、LRRC4在脑瘤中表达下调机制初步探讨

第四部分LRRC4对胶质母细胞瘤U251的影响

一、pcDNA3.1(+)/LRRC4表达重组体的构建

二、稳定表达LRRC4的U251细胞株的构建与鉴定

三、LRRC4对U251细胞体外增殖的影响

四、LRRC4基因转染对U251转化表型的影响

五、LRRC4基因转染对U251细胞体内致瘤的作用

六、LRRC4基因转染对U251细胞周期的影响

讨论

一、生物信息学在LRRC4基因克隆和功能研究中的应用

1.生物信息学在LRRC4基因克隆中的应用

2.生物信息学分析在基因功能研究中的作用

二、LRRC4的功能

1.从LRRC4的结构得到的功能启示

2.从LRRC4的表达研究得到的功能启示

3.LRRC4在脑瘤发生发展中的作用

三、LRRC4在脑瘤中功能失活的机制

四、尚需继续深入研究的课题

1.LRRC4在不同种类及不同临床分型、分级的脑瘤中的作用

2.LRRC4作用的靶分子和靶信号通路

3.LRRC4基因功能的深入研究

结 论

参考文献

综 述

致谢

个人简历