血小板无力症基因治疗基础研究

摘要

为了更好地在基因和细胞水平完善血小板无力症患者基因诊断,我们构建了基因诊断用正常pcDNA3.1(+)/GP Ⅱb和pcDNA3.1(+)/GPⅢa体外表达质粒以及正常GPⅡb和GPⅢa荧光融合蛋白表达质粒,利用测序、生物信息学分析以及体外表达等多种方法确认了GPⅡb和GPⅢa cDNA序列的正确性,以此为基础不仅可以保证基因治疗载体的序列正确,还可以利用重叠延伸法等方法构建血小板无力症患者致病突变表达质粒,建立突变体外表达细胞株,为血小板无力症确诊提供重要依据,进一步在细胞和亚细胞的水平上对血小板无力症以及GPⅡb/Ⅲa复合物缺陷的病理生理机制作出研究,评估血小板无力症基因治疗的风险性利弊.为了完善基因治疗体系的安全性和可控性,我们对血小板无力症基因治疗载体体系进行了改良,构建了GPⅡb特异启动子人类血小板膜GPⅡb/人源基因治疗载体、GPⅢa/人源基因治疗载体和人血小板膜GPⅡb/Ⅲa/核糖体基因区靶向基因治疗载体(pHrneo),以期望获得目的蛋白的高组织特异性表达和提高基因治疗载体的定点整合效率,在血小板无力症基因治疗安全性研究方面再获提高.

目录

文摘

英文文摘

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关于知识产权问题的说明

实验使用主要仪器及试剂

前言

第一部分基因诊断用血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa质粒构建及表达

第一章血小板膜糖蛋白GPⅡ b/Ⅲa/pcDNA3.1(+)表达质粒的构建和序列、表达正确性检测

1.1实验方法

1.2实验结果

1.3分析与和讨论

1.4结论

第二章血小板膜GPⅡb/Ⅲa荧光融合蛋白表达质粒的构建及表达

2.1实验方法

2.2实验结果

2.3分析和讨论

2.4结论

第二部分血小板无力症基因治疗初步研究

第三章CMV启动子人血小板膜糖蛋白GPⅡ b/Ⅲa/人源基因治疗载体构建及表达

3.1实验方法

3.2实验结果

3.3分析与讨论

3.4结论

第四章血小板无力症GPⅡb致病突变细胞株体外基因治疗初步实验研究

4.1实验方法

4.2实验结果

4.3分析与讨论

4.4结论

第五章骨髓单个核细胞和脐血干细胞体外转染、诱导分化巨核系效率初步研究

5.1实验方法

5.2实验结果

5.3分析与讨论

5.4结论

第三部分基因治疗用人血小板膜糖蛋白GPⅡ b/Ⅲa/人源基因表达载体的改良

第六章GPⅡ b特异启动子人血小板膜糖蛋白GPⅡ b/Ⅲa/人源基因治疗载体构建

6.1实验方法

6.2实验结果

6.3分析与讨论

6.4结论

第七章人血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa/核糖体基因区靶向基因治疗载体构建

7.1实验方法

7.2实验结果

7.3分析和讨论

7.4结论

附图

总结

参考文献

综述

致谢(一)

致谢(二)

攻读学位期间主要研究工作成果