脂氧合酶介导致癌物的协同氧化与天然类黄酮化合物对其活化的抑制作用

摘要

第一章脂氧合酶对化学致癌物的协同氧化活化作用 第一节SLO及HTPLO介导致癌物的协同氧化研究背景许多致癌物和致畸物(如多环芳烃、芳香胺、黄曲霉毒素B1、环磷酰胺等)需经体内代谢活化后，才能发挥其致癌和致畸作用。由于体内催化外源性化学物代谢的主要酶系——细胞色素P450(P450)以及其他已知的氧化酶类在一些肝外组织活力相对较低，甚至检测不到，很难解释外源性化学物在这些组织发生的氧化代谢。 脂氧合酶(lipoxygenase，EC1，13，11，12，LOX)是一组普遍存在于动植物体内非血红素铁蛋白。除具有双加氧作用外，近年研究表明，LOX还表现协同氧化酶(co-oxidase)活性，能介导许多外源化学物的氧化。在P450活性较低的一些肝外组织，如心、脑、肺、皮肤、子宫、胎盘、胚胎组织、血细胞等，LOX有较高的活性。研究提示，对氨基酚等化学物不被或极少被P450和前列腺素H合成酶(PGHS)代谢，考虑LOX在体外容易使它们氧化，LOX可能是这些化合物的氧化代谢过程主要或唯一催化剂。因而，有人推测LOX很可能是哺乳动物肝外组织P450氧化代谢的替代途径。 联苯胺(benzidine，BZD)是一种芳香胺类化合物，除了可引起尿道上皮癌以外，也可能与其他组织的癌症有关。近年的研究表明，BZD、苯并(a)芘(BaP)等环境化学致癌物分别可在泌尿道上皮细胞、皮肤上皮细胞、胰腺、肺等化学物致癌靶细胞中代谢。然而，P450在这些组织细胞中活化致癌物的意义相对较小。基于我们前段工作的结果和已报道的文献资料，我们提出LOX在哺乳动物肝外组织作为P450氧化活化致癌物替代途径的假设。 本课题以致癌物BZD、多种其他芳香化合物以及氯丙嗪(CPZ)为作用底物，大豆脂氧合酶(SLO)为模型酶，在体外酶系统中，初步探讨LOX对化学物的氧化活化作用，以及介导CPZ等化学物对联苯胺氧化的影响。为LOX作为肝外组织外源化学物代谢的替代途径提供进一步的证据。 方法按JosephP.吸附色谱法分离和纯化人足月胎盘脂氧合酶(HTPLO)；在体外酶系统，以SLO或HTPLO介导BZD等化合物氧化，通过检测反应产物的电子光谱，评价酶促氧化活化作用；用电子自旋波谱仪(ESR)检测反应中产生的自由基。 结论(1)在体外酶系统中，SLO和HTPLO均可介导BZD氧化为能与DNA等生物大分子结合的活化产物BZDdiimine；(2)酚噻嗪类药物能促进SLO和HTPLO对BZD氧化，其机制可能是LOX介导产生的CPZ+.或其他酚噻嗪阳离子自由基经非酶促作用氧化BZD。 第二节人胎盘细胞脂氧合酶表达与致癌物活化研究背景大量流行病学资料表明，相当多的环境化学物(包括药物)与新生儿先天畸形有关。研究表明，进入体内的许多环境化学致畸物，首先被氧化代谢酶活化为亲电子中间产物和/或自由基，再与DNA、蛋白质或脂质共轭结合，不可逆地改变细胞的功能，最终引起胚胎死亡或胎儿畸形。 研究显示包括胎盘和孕体组织在内的许多肝外组织存在着外源化学物的代谢。然而，在非吸烟妇女的胎盘缺乏P450和前列腺素合酶，很难以其解释在胎盘发生的外源化学物代谢。 JosephP.较早从人类足月胎盘提取和纯化脂氧合酶(HTPLO)。在体外酶系统中，HTPLO可催化AFB1环氧化，生成不稳定AFB1-8，9-环氧化物，后者可与DNA共价结合形成加合物，最终引起发育毒性；JosephP还证实HTPLO介导苯并芘-7，8-二氢二醇环氧化生成苯并芘-7，8-二氢二醇-9，10-环氧化物，作为终致癌物，可与生物大分子相互作用，从而促发致癌、致畸、致突变作用。还有包括我们所做的致癌物联苯胺等在内的许多致癌物和致畸物被HTPLO协同氧化活化的证据。基于以上研究结果，我们推测LOX可能是致癌物和致畸物等外源化学物在胎盘氧化活化的主要或唯一途径。但迄今为止，在这方面仅有体外酶系统研究资料；在包括胎盘在内的活体组织或细胞中，LOX能否氧化活化致癌物和致畸物，形成能与DNA等生物大分子结合的活化产物，还未见报道。 本研究，以较容易获得并有相当来源的人体胎盘组织细胞为实验材料，采用32P-后标记法、反向高效液相色谱、分子生物学等技术，探讨5-LOX在胎盘滋养层细胞中的表达，以及胎盘滋养层细胞中LOX与致癌物B[a]P氧化活化及形成DNA加合物的关系。 方法按Kliman等的Percoll连续密度梯度方法，稍作修改，分离纯化胎盘滋养层细胞；Westernblot蛋白分析检测滋养层细胞中5-LOX的表达；32P-标记后标记和RE-HPLC高效液相色谱检测BPDE-DNA加合物。 结论(1)人足月胎盘滋养层细胞存在5-LOX的蛋白质的表达；致癌物B[a]P能在胎盘滋养层细胞中活化，并形成BPDE-DNA加合物。 (2)特异性LOX抑制剂DNGA、AA-861和Zileuton均可抑制胎盘滋养层细胞中BPDE-DNA加合物形成；表明LOX参与了催化致癌物B[a]P的活化过程，本文首次为LOX在肝外组织作为P450氧化代谢的替代途径提供了活体组织研究的证据。 第二章天然类黄酮对脂氧合酶氧化活化致癌物的抑制作用研究背景大量体外酶系统研究表明，LOX对苯并芘-7，8-二氢二醇、黄曲霉毒素B1、联苯胺、丙烯晴等的协同氧化作用可能是这些致癌物的代谢活化途径之一。我们最近在体外酶系统和活体组织胎盘滋养层细胞的研究也获得类似提示，并发现LOX可介导酚噻嗪类药物致BZD等氧化活化的增强作用。在机体，LOX的这种协同氧化作用可能引起严重的后果，包括BZD和B[a]P引起的癌症。因而，探讨能抑制LOX氧化活化作用的化学物，对于减少和预防经LOX途径活化化学物而引起癌瘤将发挥重要作用。 天然类黄酮化合物(flavonoids)是一类低分子植物成分，广泛存在于蔬菜、水果和药用植物中，其毒副作用小，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗肿瘤等药理作用，是目前人们比较关注的一类化合物。有文献报道茶多酚、槲皮素、芦丁均可抑制LOX介导的花生四烯酸双加氧作用，从而抑制炎症反应、结肠癌等的发生。但除YuWK等在一篇文献中涉及槲皮素对LOX介导苯妥英氧化的影响外，未见其他有关类黄酮化合物对LOX协同氧化活性影响的报道。 本课题采用SLO和HTPLO参与的体外酶系统和人足月胎盘滋养层细胞，研究天然类黄酮化合物茶多酚、EGCG、槲皮素和芦丁对LOX介导的致癌物联苯胺、B[a]P的氧化活化和酚噻嗪所致联苯胺活化增强的影响，寻找LOX介导协同氧化的天然抑制剂；旨在探讨类黄酮通过抑制LOX介导致癌物等协同氧化的机制，而发挥其防癌和对抗其他毒性作用的可能性，为这种新的机制提出初步的证据。 方法用JosephP.吸附色谱法，分离和纯化人足月胎盘脂氧合酶(HTPLO)；按Kliman等的Percoll连续密度梯度方法，稍作修改，分离纯化胎盘滋养层细胞。 在体外酶系统，类黄酮化合物参与SLO或HTPLO介导BZD等化合物协同氧化，检测反应产物的电子光谱和用电子自旋波谱仪(ESR)检测反应中产生的自由基；采用32p-标记后标记和RE-HPLC高效液相色谱，检测类黄酮和B[a]P处理的滋养层细胞中BPDE-DNA加合物；评价类黄酮化合物对LOX协同氧化活性的抑制作用。 结论(1)研究发现，天然类黄酮化合物茶多酚、EGCG、槲皮素、芦丁对LOX介导的致癌物联苯胺和B[a]P氧化活化以及其他受试芳香化合物的氧化具有较强的抑制作用；为化学物致癌、致畸和诱变作用提供了天然化学预防剂的线索。 (2)根据研究结果，本文首次提出：对LOX协同氧化途径的抑制可能是天然类黄酮化合物防癌及对抗化学物其他毒性作用的一个新作用机制。

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文摘

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第一章脂氧合酶对化学致癌物的协同氧化活化作用

第一节SLO及HTPLO介导致癌物的协同氧化

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

6.参考文献

第二节人胎盘细胞脂氧合酶的表达与致癌物的活化

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

6.参考文献

第二章天然类黄酮对脂氧合酶氧化活化致癌物的抑制作用

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

6.参考文献

综述一：人足月胎盘脂氧合酶对外源化学物的代谢活性

综述二：肝外组织脂氧合酶及其对外源化学物的氧化代谢

致谢

简历及攻读学位期间主要研究成果