候选肿瘤抑制基因DLC-1在鼻咽癌中的初步研究

摘要

鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是我国南方常见的地方性肿瘤。病因学研究表明鼻咽癌遵循多基因、多阶段、多途径的发生发展模式，其发生与遗传因素、环境因素和EB病毒感染有关。鼻咽癌发病中显著的种族易感性和家族聚集特征表明遗传基因改变在鼻咽癌中具有十分重要的作用。肿瘤抑制基因，多为细胞周期的重要调控者，将其野生型转入瘤细胞后能明显扭转瘤细胞的恶性表型。利用肿瘤抑制基因进行靶向基因治疗为鼻咽癌基因治疗提供了新思路，也对鼻咽癌相关肿瘤抑制基因的研究提出了更多、更高的要求。 鉴于以前的研究，鼻咽癌癌变过程中肿瘤抑制基因如Fp53、R6、WAF-I、VHL及RASSFIA等主要存在表达水平的改变，而突变率很低或不存在基因突变，提示基因表达水平的改变在鼻咽癌的发生机制中可能占主导地位。因此，我们从在鼻咽癌中报道有杂合性缺失的染色体区域着手，参考OMIN数据库中提供的信息挑选候选基因AXUDI、BAPI、RASSFIA(3p21.3)和DLC-I(8p22)，通过RT-PCR的方法比较它们在41例鼻咽癌组织和16例正常鼻咽组织中是否存在表达差异，同时检测它们在鼻咽癌细胞株6-10B和5-8F中的表达情况。 初步结果表明，AXUDI和BAPI在鼻咽癌组织和正常鼻咽组织的表达不存在差异；与Lo等的报道一致，RASSFIA在鼻咽癌中的表达下调；值得注意的是，以往研究报道DLC-I不仅在肝细胞癌、非小细胞肺癌等肿瘤中表达下调，并且对这些肿瘤的发生、发展具有抑制作用，因此发现该基因在鼻咽癌中的表达下调引起了我们的注意。DLC-I上游启动子区的结构提示，该基因启动子区上游约663bp的一段序列(GeneBank Accession：AF404867)为一个G+C含量为73％的CpG岛，为了弄清楚DLG-I在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞中表达下调是否与该基因启动子区甲基化有关，我们针对DLC-I启动子序列采用甲基化特异引物M和非甲基化特异引物U分别扩增亚硫酸盐处理的DNA，即甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)的方法对DLC-I基因在39例鼻咽癌组织和13例正常鼻咽组织中的甲基化水平进行分析。然后，以0.5μM、1.0μM、5.0μM、10.0μM和100.0μM浓度的5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-Deoxycytidine，5-Aza-Dc)分别作用鼻咽癌细胞6-10B和5-8F，4天后收获细胞，检测DLC-I表达情况的变化及启动子甲基化情况的变化。 同时，我们从GenBank数据库(1lttp://www.ncbi.nlm.nih.gov)挑选了4个微卫星位点：D8S549(位于DLC-I上游约1.0 Mb)，D8S1754(位于DLC-I中)，D8S1790(位于DLC-I中)，以及D8S552(位于DLC-I下游约0.2 Mb)，覆盖整个DLC-I基因长约1.6 Mb的区域，采用PCR扩增微卫星位点，变性聚丙烯酰胺电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)分离差异条带的方法对20例鼻咽癌患者癌组织及其配对血进行杂合性丢失的分析。 另外，尽管DLC-I在其他肿瘤中突变的报道极少，碱基改变作为基因表达失活的机制之一，我们针对启动子及第一外显子区域我们利用SSCP的方法，结合测序，对DLC-I在鼻咽癌中的突变情况进行了检测。 在41例鼻咽癌组织，16例正常鼻咽组织和4个鼻咽癌细胞中：研究表明．DLC-I在正常组织中广泛表达，我们的结果与以往研究一致，所有正常鼻咽组织均表达DLC-I；DLC-I在鼻咽癌组织中的表达明显下调(P=0.001)；在鼻咽癌细胞HNEl、CNE2、5-8F和6-10B均未检测到DLC-I的表达。统计学分析表明DLC-I的表达在男与女、有无淋巴结转移鼻咽癌患者中不存在差异(I)=0.063，P=0.057)。 甲基化特异性PCR(MSPCR)结果：79％(31／39)的鼻咽癌组织和2个鼻咽癌细胞(5-8F和6-10B)发生了甲基化。但是，30.7％(4／13)的正常鼻咽组织也有甲基化的情况。在鼻咽癌患者中男与女的甲基化比率不存在差异(P=0.682)。 LOH结果：D8S552、D8S1754、D8S1790和D8S549的缺失率分别为33％(4／12)、18％(2／11)、5％(1／18)和25％(3／12)。其中35％(7／20)的鼻咽癌组织至少发生了一个微卫星位点的LOH。 突变检测结果表明，15例鼻咽癌患者中，在翻译起始密码子ATG上游的第29个碱基发生了A→T置换改变，其中4例表现为“T”单峰，为纯合性改变；5例表现为“A”和“T”双峰，为杂合性改变。 综上所述，候选肿瘤抑制基因DLC-I在鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞中的表达均明显下调，DLC-I启动子甲基化、杂合性丢失和启动子上游的碱基改变均存在于鼻咽癌中的现象提示，说DLC-1的表达失活可能涉及多种机制的共同参与。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写

前言

第一章材料和方法

第二章实验结果

第三章讨论

结论

参考文献

综述 肿瘤相关基因的研究方法概要

致谢

攻读学位期间主要的研究成果目录及附件