候选肿瘤抑制基因RASSF1A在鼻咽癌中的遗传学和表观遗传学研究

摘要

鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma，NPC)是中国南方广东人群中最常见的一种恶性上皮肿瘤，发病率居世界首位，达30～50/10万，但在世界大多数地区比较少见。鼻咽癌作为一种多因素复杂性疾病，其发病与Epstein-Barr病毒(EBV)的感染、遗传学和表遗传学的改变有关。鼻咽癌同时又具有明显的地域性、种族性和家族聚集性，这些事实提示着遗传易感性在部分人群中的存在。目前的研究结果表明，在4p14-4q11、3号染色体短臂(3p)和HLA相关区域可能存在鼻咽癌易感基因，但还没有克隆出一个真正的鼻咽癌易感基因。3p在高达95～100％的鼻咽癌和75％的癌前病变中发生杂合性丢失(Lossofheterozygosity,LOH)，以及直接功能学的研究结果也证实3p21.3具有抑制鼻咽癌细胞的功能，这些都提示提示3p缺失区域中存在与鼻咽癌发生密切相关的抑癌基因。RASSF1A就是近年来在该区域克隆的一个新的候选抑癌基因，在多种不同类型的人类肿瘤中都存在启动子区异常高甲基化和表达下调或缺失。初步的功能研究显示，异源表达RASSF1A具有抑制鼻咽癌细胞株C666-1恶性表型的功能。本研究的目的就是利用广东鼻咽癌人群特有的资源，对RASSF1A基因在散发性鼻咽癌组织和细胞系中进行广泛地突变、甲基化和表达检测，以期鉴定RASSF1A是否参与了散发性鼻咽癌的发生发展的过程，探索其与散发性鼻咽癌之间的相互关系，为进一步对鼻咽癌的临床分子诊断、预后和治疗奠定基础。 本研究采用PCR-克隆-测序的方法对RASSF1A基因的编码区、内含子-外显子拼接位点，以及部分的5’、3’-UTR在23例散发性鼻咽癌组织中进行了突变检测。并利用PCR-直接测序的方法对RASSF1A基因在5例鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2、HNE1、SUNE1和C666-1)和23例鼻咽癌组织匹配的外周血中进行突变检测。结果在CNE2和SUNE1细胞株中发现一个杂合性错义突变(Leu279Val)；除去已确认的一个cSNP(AAG21CAG)外，在17例(17/23)鼻咽癌中共检测到35个核苷酸位点变异。其中14例(14/17)在RASSF1A基因中含有2个以上位点的改变，3例在RASSF1A基因仪发现一个核苷酸位点的变异。在35个变异位点中，GCT133TCT(Ala133Ser)的改变在2例组织和匹配外周血中检测到，说明在此位点可能发生种系细胞的改变或是一个少见的多态；其余的34个改变位点均只在鼻咽癌组织中发现，而在匹配的外周血样本中没有发现，说明这些改变都为体细胞突变。在检测到的35个突变中，3个为无义突变(即终止密码子突变)，26个为错义突变，2个发生单碱基缺失造成移码突变，其余的四个为同义突变(沉默突变)而不改变氨基酸序列。3个无义突变分别位于密码子145(CAG→TAG)、253(CAA→TAA)和293(TGG→TGA)，并且分布在3、11和17号鼻咽癌组织标本中。而2个发生单碱基缺失的移码突变分别位于密码子238(GAC→del(C))和294(GAC→del(G))，两个突变却分布在同一个鼻咽癌样本(3号样本)中。在35个不同位点的变异中，14个改变发生在外显子2αβ内，10个改变发生在RASSF1A的第四个外显子内，其余11个变异分别位于外显子1α(1个)、外显子3(4个)、外显子5(2个)和外显子6(4个)中。其中，43％(15/35)的突变发生在3个假定的功能结构域中，DAG结构域和RA结构域中分别分布有七个不同的变异位点，ATM结构域中也有一个变异位点。在检测到的35个变异中，密码子117的错义突变(ACG117GCG(Thr→Ala)发生频率最高，为17.39％(4/23)，分别在四个不同的鼻咽癌组织样本中检测到有同样的改变。而三个无义突变和两个单碱基缺失造成的移码突变，分别只在一个鼻咽癌组织中检测到，其突变频率为4.35％(1/23)。在这些检测到的突变中，除Ala133Ser变异有其它文献报道外，细胞株的Leu279Val变异和其它的34个突变均没有被报道过，这些突变为第一次在广东人群的鼻咽癌组织中新发现的突变。这些高频的体细胞突变，提示突变是RASSF1A基因失活的原因之一，并可能参与了鼻咽癌的发生发展。 再利用甲基化特异性PCR(MSP)对23例散发性鼻咽癌组织进行了RASSF1A基因启动子区CpG岛的甲基化检测。结果发现，RASSF1A启动子区CpG岛在4例(4/5)的鼻咽癌细胞株中发生甲基化，其中在C666-1完全甲基化，在HNE1、SUNE1和CNE1中部分甲基化，而在CNE2中未出现甲基化。在17例(17/23)鼻咽癌组织中发现了RASSF1A基因启动子甲基化，其中2例出现完全甲基化；而在匹配的外周血样本中，未发现RASSF1A基因启动子的甲基化。并利用Fisher’sexacttest的统计学方法分析了一系列临床病理学参数与RASSF1A基因甲基化状态的关系，结果发现发生RASSF1A基因甲基化病例组与非甲基化的病例组没有显著的年龄差异(P=0.268)；同样也没有性别、临床分期以及EBV抗体滴度上的显著性差异。这些结果也提示，在鼻咽癌中RASSF1A基因启动子区异常高甲基化也是其失活的另一个主要机制。 在最后还利用半定量RT-PCR在20例新鲜的鼻咽癌活检组织、5例鼻咽癌细胞株和10例作为非癌对照的慢性鼻咽炎的活检组织中进行RASSF1A基因的表达检测。结果发现，在C666-1细胞株中，RASSF1A表达缺失，在其余四个NPC细胞株中，RASSF1A表达有明显的下调。在20例鼻咽癌组织中，2例呈现RASSF1A表达显著性降低几乎不表达，12例(12/20)RASSF1A表达降低，其余6例RASSF1A基因表达未见明显变化。在几乎所有表达RASSF1A的鼻咽癌组织中，均伴随有RASSF1F的表达，而在鼻咽炎非癌对照中，RASSF1F的表达比率明显降低。由于两种异构体使用同一启动子，在鼻咽癌中RASSF1F的表达可能导致RASSF1A表达效率的降低而引起单倍性剂量不足。这些结果提示，RASSF1A基因的表达缺失或表达下调，与鼻咽癌的发生发展有一定的关系。 总而言之，通过对RASSF1A基因在广东鼻咽癌中的突变、启动子区甲基化和表达的分析，验证了RASSF1A基因在散发性广东鼻咽癌中异常。依据修改的Knudson的“二次打击”模型，第一次“打击”常常是点突变、小的缺失，或表遗传学事件，接着第二次“打击”则是染色体丢失或杂合性缺失。RASSF1A基因在鼻咽癌发生过程中的第一次“打击”可能点突变或表遗传学沉默，接着的第二次“打击”则可能是3p的杂合性缺失。这些遗传学和表遗传学的改变，提示RASSF1A基因在散发性鼻咽癌的发生发展中扮演了一个重要的角色。本研究为理解RASSF1A在鼻咽癌细胞中的作用与功能提供了初步的分子遗传学根据，也为寻找鼻咽癌的早期诊断和预后判断的分子遗传标记物打下了一定的基础。但该基因在鼻咽癌中高频突变的突变体的具体功能和作用机制值得进一步探讨。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

前言

第一章RASSF1A基因在鼻咽癌中的突变检测

1.1材料与方法

1.2结果与分析

1.3讨论

第二章RASSF1A基因在鼻咽癌中的甲基化研究

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第三章RASSF1A基因在鼻咽癌中的表达分析

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

全文总结

参考文献

候选抑癌基因RASSF1A研究进展

在读期间所发表的文章

致谢

原创性声明