RNA干扰抑制结肠癌细胞SW620VEGF基因表达及其对SW620细胞生物学行为影响的实验研究

摘要

目的：利用RNA干扰技术抑制结肠癌细胞SW620中血管内皮生长因子(VEGF)基因的表达，并探讨其对SW620细胞生物学行为的影响。 方法：构建hVEGF-shRNA质粒表达载体，通过Lipofectamine2000脂质体转染试剂将bVEGF-shRNA质粒表达载体转染人结肠癌细胞SW620，G418筛选稳定表达hVEGF的细胞株；通过ELISAWestern blot及RT-PCR研究hVEGF-shRNA质粒表达载体对SW620VEGF表达的影响；通过检测稳定转染细胞生长曲线和细胞周期、肿瘤细胞与细胞外基质粘附实验、肿瘤细胞与内皮细胞粘附实验、肿瘤细胞迁移运动实验、细胞侵袭实验、结肠癌皮下成瘤和结肠癌肝转移动物模型及体外血管生成实验研究干扰结肠癌细胞SW620VEGF的表达对结肠癌细胞株SW620生物学行为的影响。 结果： 1)成功构建了4条hVEGF-shRNA质粒表达载体：hVEGF1-shRNA，hVEGF2-shRNA，hVEGF3-shRNA，hVEGF4-shRNA。 2)成功构建了4株稳定转染hVEGF-shRNA质粒表达载体结肠癌细胞株：SihVEGF-1、SihVEGF-2、SihVEGF-3、SihVEGF-4细胞及阴性对照HK细胞。 3)hVEGF-shRNA质粒表达载体有效抑制SW620细胞株VEGF蛋白质及mRNA的表达(p<0.05)，其中hVEGF4-shRNA抑制效果最强；而阴性对照HK质粒表达载体则对SW620细胞株VEGF蛋白质及mRNA的表达影响不大(p>0.05)。 4)与SW620细胞相比，SihVEGF-4细胞生长明显变慢、增殖的能力受到阻滞、与细胞外基质和内皮细胞间黏附明显下降、迁移运动能力和侵袭能力明显下降(p<0.05)；而HK细胞生长、增殖的能力、与细胞外基质和内皮细胞间黏附能力、迁移运动能力和侵袭能力与SW620没有明显区别(p>0.05)。瞬时转染hVEGF4-shRNA表达载体的内皮细胞没有形成明显的管腔样结构，而瞬时转染阴性对照(HK)ECV304细胞与正常ECV304没有明显区别都形成明显的管腔样结构。 5)结肠癌皮下成瘤和结肠癌肝转移动物模型中，与SW620细胞相比，SihVEGF-4细胞成瘤性及转移性能受到明显抑制，SihVEGF-4所形成的皮下肿瘤组织VEGF165 mRNA、VEGF189 mRNA、VEGF121 mRNA有效抑制，其中VEGF165mRNA表达受抑制最强，而VEGF189最弱，免疫组化结果显示MVD明显下降，VEGF表达受阻(p<0.05)；而HK细胞与SW620没有明显差别(p>0.05)。 结论：hVEGF-shRNA质粒表达载体能有效抑制结肠癌细胞SW620VEGF表达；通过抑制结肠癌细胞SW620VEGF的表达，结肠癌SW620细胞的恶性增殖、浸润及转移的能力受到抑制，从而达到治疗肿瘤的目的。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

技术路线

第一章hVEGF-shRNA质粒表达载体的构建

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4实验结论

5讨论

参考文献

第二章hVEGF-shRNA质粒表达载体稳定转染SW620细胞株的建立及其对SW620细胞VEGF表达的影响

1实验材料

2转染细胞的准备

3 SW620细胞G418敏感实验

4质粒DNA的无菌化处理

5 hVEGF-shRNA质粒表达载体转染SW620细胞及稳定转染细胞株的筛选

6 ELISA检测SW620细胞、转染细胞培养上清液中VEGF蛋白的含量

7 RT-PCR检测SW620细胞、转染细胞中VEGFmRNA的表达

8 Western-blot分析

9统计学处理

10实验结果

11讨论

参考文献

第三章稳定转染hVEGF-shRNA质粒表达载体SW620细胞株生物学行为的研究

1实验材料

2细胞培养

3稳定转染hVEGF-shRNA质粒表达载体SW620细胞株生物学行为的研究

4结肠癌动物模型的建立

5组织VEGFmRNA的表达

6统计学处理

7结果

8讨论

参考文献

综述VEGF家族

致谢

在读期间发表论文及获奖情况