RNA干扰技术抑制HGF表达对人结肠癌细胞SW620的增殖和移行行为的影响

摘要

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，占消化道恶性肿瘤的第二位，严重威胁到人类的健康。目前，临床上常用的结直肠癌的治疗方法如手术、放疗和化疗等虽然具有一定的疗效，但是创伤大，副反应重，预后差。因此，寻求一种新的、副反应小、治疗效果更好的方法势在必行。现已证实，结直肠癌的发展是一个多步骤、多阶段及多因素参与的疾病，而癌基因的变异及其参与的信号转导与肿瘤发展的关系极为密切。在众多信号传导网络中，蛋白酪氨酸激酶受体通路是最重要的传导通路之一。这也正是肝细胞生长因子（Hepatocyte Grouth Factor，HGF），及其受体c-Met的信号转导通路的首要环节。
　　 肝细胞生长因子HGF又称分散因子（scatter factor，SF）是一种多肽生长因子，具有强促有丝分裂、组织器官成形、诱导上皮细胞迁移、侵袭以及诱导血管生成等作用。近年研究表明，在某些病理过程中，特别是在一些恶性肿瘤组织中包括结直肠癌在内，HGF/c-Met存在突变、过表达，而且与肿瘤发生、发展、转移及患者预后有密切关系。有研究表明，结直肠癌患者血清中HGF含量显著升高，其中合并肝转移的结直肠癌患者的血清中HGF含量较无肝转移的患者更高，推测HGF对结直肠癌的诊断、分期和预后的判断可能具有一定的价值，特别是对于结直肠癌患者有无肝转移将是一个很有价值的判断指标。因此，HGF极有可能成为新的结直肠癌治疗靶点。
　　 RNA干扰（RNA interference，RNAi）是将与靶基因的mRNA同源互补的双链RNA（dsRNA）导入细胞，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失，属于转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silence，PTGS）。目前，RNAi技术已经迅速而广泛的应用到基因功能鉴定、基因表达、转录后调控等热门研究领域，并为多种疾病的基因治疗提供了新的思路，尤其在肿瘤的基因治疗方面显示出诱人的前景。其中小分子干扰双链RNA（small interfering RNA， siRNA）是RNAi途径中的中间产物，它启动了细胞内RNAi的反应。有效的siRNA，能产生类似基因敲除的效果，为肿瘤的基因治疗开辟了新的途径。
　　 我们前期实验已证明HGF可以促进人结肠癌细胞SW620的增殖和移行，并呈质量浓度依赖性。本实验采用RNAi方法抑制HGF基因表达，进一步探讨HGF对人结肠癌细胞株SW620的增殖和移行的影响，以期寻找治疗结直肠癌的新方法。
　　 目的：探讨采用RNA干扰方法抑制HGF基因表达对结肠癌细胞SW620增殖、侵袭的影响。
　　 方法：
　　 1本实验用脂质体LIPOFECTAMINETM2000介导，将Santa公司设计并合成的特异性的HGFα/βsiRNA转染入人结肠癌细胞株SW620，同时设立阴性对照和空白对照。在倒置荧光显微镜下测定细胞的瞬时转染效率。
　　 2用Western Blot和RT-PCR方法检测细胞中HGF的mRNA和蛋白表达改变情况。
　　 3倒置显微镜下观察各组细胞的形态学变化。
　　 4 MTT检测细胞增殖活性的变化情况，并绘出各组细胞的生长曲线。
　　 5流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期变化。
　　 6基底膜重建实验比较各组细胞的移行能力。
　　 7扫描及透射电镜检测各组细胞的超微结构变化。
　　 结果：
　　 1倒置荧光显微镜下可观察到细胞瞬时转染效率约为70-80％。
　　 2 Western Blot和RT-PCR方法检测转染HGFα/BsiRNA后SW620细胞中HGF的mRNA和蛋白表达均较对照组显著降低（p<0.05）。
　　 3倒置显微镜下观察发现，在转染后48小时，转染HGFα/β siRNA组，细胞增殖明显减少，细胞数量减少，细胞聚集情况明显抑制。
　　 4 MTT结果显示，24、48、72和96小时四个时间段细胞的OD值，实验组与阴性对照组和空白对照组比较均有差异（p<0.05），实验组细胞增殖能力明显减弱，且效果在48小时最显著，此时其增殖能力抑制率>50％。
　　 5流式细胞术结果显示，与阴性对照组和空白对照组相比，实验组中的G1期细胞明显增多，S期细胞减少。
　　 6基底膜重建实验显示，实验组移行能力比阴性对照组降低58.2％，比空白对照组降低60.3％。
　　 7扫描电子显微镜下观察到：实验组SW620细胞表面伪足成细丝状，突起数量减少。阴性对照组和正常对照组细胞可见粗壮的伪足，数目较多，有较明显的突起，且分布密集。
　　 8透射电子显微镜观察SW620细胞的超微结构发现：RNA干扰后细胞内未见微管，只见少量微丝呈散在分布。阴性对照组和正常对照组在核旁的胞质里可见较长较多的微管平行排列，微丝成束。
　　 结论：应用RNA干扰技术抑制HGF的表达后明显抑制人结肠癌细胞株SW620的增殖和移行。

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结果

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结论

参考文献

综述 肝细胞生长因子与肿瘤的发展与治疗

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