趋化因子受体CXCR4对骨肉瘤细胞株肺转移的影响

摘要

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，肺部是其发生远处转移最主要的部位，约占所有转移的90％，约85％的患者就诊时就存在不同程度的肺部转移灶，是骨肉瘤患者的主要死因。因此，骨肉瘤肺转移的研究对改善预后和提高生存率至关重要。目前，骨肉瘤的研究较多，但骨肉瘤特异性肺转移的分子机制的研究则较少。 趋化因子受体CXCR4(Chemokine receptor 4)是基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)的受体，是一个高度保守的G蛋白偶联七次跨膜受体。近几年的研究显示SDF-1/CXCR4生物学轴在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌和血液系统恶性肿瘤的器官特异性转移中发挥着重要的驱动、导向和定位作用，但CXCR4在骨肉瘤肺转移中作用的研究则很少。 第一部分 目的：研究趋化因子受体CXCR4的表达水平与骨肉瘤肺转移的关系，探讨CXCR4在骨肉瘤组织中表达的临床意义。 方法：采用免疫组化法测定5例胸片发现肺部明显肿块(高疑肺转移)及11例胸片未见肺部肿块的骨肉瘤患者的原发灶组织中CXCR4的表达水平。 结果：CXCR4在16例骨肉瘤组织中均有表达，但肺部有明显肿块(高疑肺转移)的骨肉瘤组织中CXCR4的表达水平(80.52±9.93)明显高于肺部未见明显肿块的骨肉瘤组织(65.56±12.75)，有显著性差异，P<0.05。 结论：肺部有明显肿块(高疑肺转移)的骨肉瘤组织中CXCR4的表达水平显著增高，提示CXCR4可能参与了骨肉瘤的肺转移，为进一步的研究提供线索。 第二部分骨肉瘤细胞株CXCR4的表达水平与体外侵袭能力的相关性研究 目的：探讨趋化因子受体CXCR4对骨肉瘤细胞株的体外侵袭能力的影响。 方法：采用有限稀释法，从人骨肉瘤细胞系MG-63中分离培养出细胞株，用免疫组化的方法挑选出高表达和低表达CXCR4蛋白的细胞株各一株，用RT-PCR的方法进一步检测其CXCR4 mRNA的表达情况，然后采用transwell侵袭实验观察细胞株的体外侵袭和转移能力及CXCR4特异性抗体对其侵袭和转移能力的影响。 结果：①获得并挑选出CXCR4蛋白高表达(B8)和低表达(G5)的骨肉瘤细胞株各一株；②CXCR4蛋白高表达的骨肉瘤细胞株的表达水平(94.74±17.35，B8)明显高于低表达的骨肉瘤细胞株(41.86±6.54，G5)，有显著性差异，P<0.01；③B8细胞株中CXCR4mRNA的表达水平(1.37±0.36)明显高于G5细胞株(0.44±0.13)，有显著性差异，P<0.01；④B8细胞株的穿膜细胞数(53.60±15.37)明显多于G5细胞株(19.6±8.20)，有显著性差异，P<0.01；⑤CXCR4特异性抗体干预后的穿膜细胞数(21.8±8.53)明显少于干预前(53.60±15.37)，有显著性差异，P<0.01；⑥细胞株中CXCR4蛋白的表达水平与其体外侵袭能力呈正相关，有统计学意义，P<0.0l；⑦细胞株中CXCR4 mRNA的表达水平与其体外侵袭能力呈正相关，有统计学意义，P＜0.05。 结论：在国内首次发现高表达CXCR4蛋白、CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞容易发生体外的侵袭和转移，而这种体外的侵袭和转移反应可被CXCR4特异性抗体抑制，提示CXCR4在骨肉瘤细胞的体外侵袭和转移中发挥着重要作用。 第三部分小干扰RNA对骨肉瘤细胞株CXCR4基因表达和侵袭力的影响 目的：研究小干扰RNA(siRNA)对骨肉瘤细胞株中趋化因子受体CXCR4基因表达和体外侵袭能力的影响。 方法：设计及化学合成针对CXCR4基因的特异性siRNA，采用脂质体法转染高表达CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞株，转染后采用RT-PCR的方法检测CXCR4基因表达水平的变化，并采用transwell侵袭实验观察其体外侵袭能力的变化。 结果：①成功地设计和合成了针对CXCR4基因的特异性siRNA；②顺利地将CXCR4 siRNA转染入高表达CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞株，其转染效率为43.82±3.02％；③转染后CXCR4 mRNA的表达水平(0.41±0.05)明显低于阴性对照组(0.75±0.08)和空白组(0.72±0.08)，有显著性差异，P＜0.01；④转染后穿过侵袭膜的细胞数(3 1.20±7.1)明显少于转染前的细胞数(53.66±15.37)，有显著性差异，P＜0.0l。 结论：①成功地合成了CXCR4 siRNA并将其转染入骨肉瘤细胞； ②在国内首次发现CXCR4 siRNA能下调骨肉瘤细胞CXCR4基因的表达水平和抑制其体外侵袭能力，提示CXCR4在骨肉瘤细胞的体外侵袭和转移中发挥着重要作用，为利用siRNA防治骨肉瘤的转移奠定了理论基础。 第四部分CXCR4对骨肉瘤细胞株的裸鼠肺转移的影响 目的：研究趋化因子受体CXCR4对骨肉瘤细胞株的裸鼠体内肺转移的影响。 方法：将高表达和低表达CXCR4蛋白、CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞株分别接种于裸鼠的颈背部皮下并于4周后处死裸鼠，观察其肺部的转移情况并分级。 结果：①高表达CXCR4蛋白、CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞株的裸鼠肺转移灶的级数(84.40±14.79)大于低表达的骨肉瘤细胞株(32.004±8.00)，有显著性差异，P<0.01；②细胞株中CXCR4蛋白的表达水平与裸鼠体内肺转移能力呈正相关，有统计学意义，P<0.01；③细胞株中CXCR4 mRNA的表达水平与裸鼠体内肺转移能力呈正相关，有统计学意义，P<0.05。 结论：在国内首次发现高表达CXCR4蛋白、CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞在裸鼠体内容易发生肺转移，提示CXCR4在骨肉瘤细胞的裸鼠体内肺转移过程中发挥着重要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

第一章CXCR4在骨肉瘤组织中的表达及意义

1.1前言

1.2材料与方法

1.3结果

1.4讨论

1.5结论

第二章骨肉瘤细胞株CXCR4的表达水平与体外侵袭能力的相关性研究

2.1前言

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

2.5结论

第三章小干扰RNA对骨肉瘤细胞株CXCR4基因表达和侵袭力的影响

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果

3.4讨论

3.5结论

第四章CXCR4对骨肉瘤细胞株的裸鼠肺转移的影响

4.1前言

4.2材料与方法

4.3结果

4.4讨论

4.5结论

附录

参考文献

综述一 SDF-1/CXCR4生物学轴与肿瘤转移

综述二 骨肉瘤的转移

致谢

攻读学位期间主要的研究成果