用于抑制E-选择蛋白和CXCR4趋化因子受体的双靶向化合物

摘要

本发明公开了一种用于抑制E‑选择蛋白和CXCR4趋化因子受体的双靶向化合物，以及用于治疗癌症和炎性疾病、将诸如干细胞(例如，骨髓祖细胞)的细胞释放到循环血液中并增强细胞在血液中的保留的化合物、组合物和方法。更具体而言，在E‑选择蛋白抑制剂结构上引入硫酸酯基团，以提高E‑选择蛋白活性，增加P‑选择蛋白活性，通过连接高活性CXCR4抑制剂以提高药物的总体效果。

说明书

技术领域

本文公开了用于治疗和/或预防包括炎性疾病和癌症在内的至少一种疾病、病症和/或疾病状态的化合物、组合物和方法，具体而言，本发明涉及抑制E-选择蛋白和CXCR4趋化因子受体的双靶向化合物及其用途。

背景技术

当组织被感染或受损时，炎症过程将白细胞和其它免疫系统组分引导至感染或损伤部位。在此过程中，白细胞在微生物的吞噬和消化中起重要作用。白细胞向受感染或受损组织的募集对于建立有效的免疫防御至关重要。

选择蛋白是一类结构类似的血管内皮细胞表面受体，其主要作用之一是介导白细胞与血管内皮细胞结合，将白细胞征集至受感染或受损的组织，是免疫防御的关键步骤。

有三种已知的选择蛋白：E-选择蛋白，P-选择蛋白和L-选择蛋白。E-选择蛋白存在于活化的内皮细胞的表面，其排列在毛细血管的内壁上。E-选择蛋白结合碳水化合物唾液酸化的-Lewis

血管生成对癌症的进展至关重要。越来越多的证据表明，选择蛋白在血管生成中起着重要作用。从活化的血管内皮细胞释放的E-选择蛋白是一种粘附分子，它通过募集和激活各种白细胞至炎症部位而在炎症反应中起主要作用。肿瘤血管系统处于发炎状态，表达包括E-选择蛋白在内的多个重要因子，研究也表明，E-选择蛋白与肿瘤免疫抑制相关的肿瘤核心血管系统中，E-选择蛋白在肿瘤周围血管系统中的表达更为广泛。

某些癌症全部或部分起源于骨中，如果能在癌症离开原发部位之前进行治疗，很多癌症的可治疗性都很高。然而，一旦癌症从原发部位散播，通常治疗选择就很有限了，并且存活的统计数据显著下降。因此，需要防止癌细胞离开原发部位或防止癌细胞从血流外渗并浸润其它组织。将癌细胞保留在血流中使细胞对诸如化疗的治疗的敏感性更强。

选择蛋白抑制剂主要用于阻止癌细胞通过血液转移。复发及转移性癌细胞表面大量表达唾液酸路易斯糖(SLe

研究表明，E-/P-选择蛋白抑制剂可以有效阻止血液癌细胞对骨髓的粘附。对于各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤等，部分癌细胞粘附于骨髓及其它组织的血管内皮，是造成药物阻抗及病情复发的主要原因。选择蛋白抑制剂能有效阻止这种粘附作用，并将粘附的癌细胞释放到血液中，有效提高化学治疗效果。

另外，CXCR4属于CXC趋化因子受体家族，是趋化因子基质细胞衍生因子-I(SDF-1，CXCL12)的特异性受体，与SDF-I结合后会使细胞产生趋化作用。CXCR4趋化因子表达于多种细胞表面，在身体免疫系统和循环系统的生长发育中起着重要的作用。CXCR4趋化因子在很多癌组织中过量表达，在肿瘤细胞的增殖、侵润、血管增生以及转移中起到非常重要的作用。CXCR4在23种不同类型肿瘤中均有表达，是肿瘤细胞表达最为普遍的趋化因子受体。在乳腺癌患者中，CXCR4高表达和癌转移正比例相关，且预后较差。在结直肠癌患者中，CXCR4高表达与肿瘤的复发和转移正比例相关，并且相应患者生存率也较低。在卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、神经母细胞瘤等其他肿瘤的研宄中也得到了相似的结果。因此，CXCR4也是靶向治疗肿瘤及肿瘤转移的研究新热点。

目前已有一些用于抑制E-选择蛋白和CXCR4趋化因子受体的异双功能化合物(参见，例如，61/174，5802009.05.01US)。但是现有的技术方案中，E-/P-选择蛋白的活性较低，只能与低活性的CXCR4趋化因子受体抑制剂配合连接，化合物的整体活性不高，导致最终药物剂量需求大，不利于对应疾病的治疗。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种用于治疗疾病和用于改进E-选择蛋白及CXCR4趋化因子受体发挥作用的化合物、组合物和方法。在本发明中，化合物是双靶向抑制剂，其中E-选择蛋白抑制剂连接于CXCR4趋化因子受体抑制剂，在E-选择蛋白抑制剂结构上引入硫酸酯基团，以提高E-选择蛋白活性，增加P-选择蛋白活性，通过连接高活性CXCR4抑制剂以提高药物的总体效果。所述化合物可以与药学可接受的载体或稀释剂组合而形成药物组合物。所述化合物可用于治疗癌细胞可能离开原发部位的癌症，或用于治疗疾病中发生细胞的粘附或迁移的炎性疾病，或用于将诸如干细胞(例如，骨髓祖细胞)的细胞释放到循环血液中并增强所述细胞在血液中的保留(例如，使细胞移出骨髓并将所述细胞保留在外周血流中)。

本发明提供用于抑制E-选择蛋白和CXCR4趋化因子受体的双靶向化合物，该化合物具有下式：

其中：

L为连接子基团，CD为CXCR4趋化因子受体抑制剂；

R

R

R

R

R

在一些实施方案中，Y

在一些实施方案中，该化合物具有下式：

其中L为连接子基团，CD为CXCR4趋化因子受体抑制剂。

在一些实施方案中，该化合物具有下式：

其中L为连接子基团，CD为CXCR4趋化因子受体抑制剂。

在一些实施方案中，CD为四氢奎诺林基CXCR4趋化因子受体抑制剂、对二甲苯烯二胺基CXCR4趋化因子受体抑制剂、吲哚基CXCR4趋化因子受体抑制剂或环五肽基CXCR4趋化因子受体抑制剂。

在一些实施方案中，该化合物具有下式：

其中L为连接子基团。

在一些实施方案中，该化合物具有下式：

其中L为连接子基团。

在一些实施方案中，该化合物具有下式：

其中L为连接子基团。

在一些实施方案中，该化合物具有下式：

其中L为连接子基团。

在一些实施方案中，该化合物具有下式：

其中L为连接子基团。

在一些实施方式中，化合物的连接子基团L为-(CH

在一些实施方式中，化合物的连接子基团L为-NHC(O)(CH

在一些实施方式中，化合物的连接子基团L为-(CH

在一些实施方式中，化合物的连接子基团L具有下列结构式：

在一些实施方式中，化合物的连接子基团L具有下列结构式：

本发明提供包含本发明化合物和药学可接受的载体或稀释剂的药物组合物，以上化合物可以用于制备药物，该药物可以用于治疗癌细胞可能离开原发部位的癌症、希望使癌细胞从某一位置移动到血流并将所述癌细胞保留在所述血流中的癌症、将干细胞释放到循环血液中并增强所述细胞在所述血液中的保留的药物或疾病中发生细胞粘附或迁移的炎性疾病。

本发明的有益效果是：

(1)在E-选择蛋白上引入硫酸酯基团，大幅提升了E-/P-选择蛋白的活性；

(2)由于E-/P-选择蛋白活性得以提高，该双靶向化合物可连接更高活性的CXCR4抑制剂，化合物的整体活性亦得到提升，从而可降低最终药物的使用剂量。

附图说明

图1(图1A、图1B、图1C、图1D及图1E)是本发明一种实施方式中双靶向化合物C4的合成示意图；

图2是化合物A和C4对E-选择蛋白的IC

具体实施方式

如上文所述，本发明提供了用于治疗E-选择蛋白和CXCR4趋化因子受体发挥作用的基本，以及用于增强细胞在释放到循环血液中后的保留的化合物、组合物及方法。所述化合物具有多种体外和体内用途。

本文所用的术语“E-选择蛋白抑制剂”是指E-选择蛋白的抑制剂，以及E-选择蛋白和P-选择蛋白或L-选择蛋白或E-选择蛋白和P-选择蛋白和L-选择蛋白的抑制剂。

本发明的化合物是双靶向化合物，其中E-选择蛋白抑制剂与CXCR4趋化因子受体抑制剂连接(即共价连接)。该化合物包含下式或由下式组成：E-选择蛋白抑制剂——连接子基团——CXCR4趋化因子受体抑制剂。

在一种实施方案中，化合物具有下式结构：

其中L为连接子基团，CD为CXCR4趋化因子受体抑制剂。

在一种实施方案中，化合物具有下式结构：

其中L为连接子基团，CD为CXCR4趋化因子受体抑制剂。

CXCR4趋化因子受体抑制剂是本领域公知的，该抑制剂通常可以阻止基质衍生因子-1(SDF-1)与CXCR4受体的结合。CXCR4趋化因子受体抑制剂的实施方案包括：

四氢奎诺林基CXCR4趋化因子受体抑制剂：

对二甲苯烯二胺基CXCR4趋化因子受体抑制剂：

吲哚基CXCR4趋化因子受体抑制剂：

环五肽基CXCR4趋化因子受体抑制剂：

在本发明的化合物中，E-选择蛋白抑制剂和CXCR4趋化因子受体抑制剂通过连接子基团共价连接，连接子基团可以是或包括间隔基团，例如-(CH

其它连接子基团为本领域技术人员熟悉的或为本公开所有，例如聚乙二醇PEG链-(CH

在另一种实施方案中，连接子基团为-NHC(O)(CH

在另一种实施方案中，连接子基团具有下列结构式：

在本发明的一种实施方案中，该化合物具有下列结构式：

其中，L为连接子基团，CD为CXCR4趋化因子受体抑制剂。

在本公开中，有数个化学缩写：Me为甲基，Bz为苯甲酰基。

R

R

R

R

本文所用的“C

本文所用的“C

本文所用的“C

本文所用的“芳基”是指具有6-18个碳原子的芳香族取代基，这些碳原子是作为一个或多个环中的环原子，所述一个或多个环可以被键隔开或可以是稠合的。“杂芳基”与“芳基”相似，但是芳族取代基具有至少一个取代环碳的杂原子(例如N、O或S)，其可能具有少于6个碳环原子。“芳基”与“杂芳基”的实例包括苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、三唑基、呋喃基、恶唑基、苯硫基、喹啉基和联苯基。

在一些实施方式中，硫酸酯盐Y

在一种实施方式中，连接子基团为

在一种实施方式中，连接子基团为

在一种实施方式中，连接子基团为

在一种实施方式中，连接子基团为

在一种实施方式中，连接子基团为

在一种实施方式中，连接子基团为

在一种实施方式中，连接子基团为

本文所述的化合物可以存在于药物组合物中。药物组合物包含与一种或多种药学或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合的一种或多种化合物。所述组合物可以包含缓冲液、碳水化合物、甘露醇、蛋白、多肽或诸如甘氨酸的氨基酸、抗氧化剂、诸如EDTA或谷胱甘肽的螯合剂、诸例如氢氧化铝的佐剂或防腐剂。在其他实施方案中，本发明的组合物可以被配制为冻干制剂。可以根据任何合适的给药方式来配制本发明的组合物，所述给药方式包括例如，局部给药、口服给药、鼻腔给药、静脉内给药、颅内给药、腹膜内给药、皮下给药或肌肉内给药。

在一个实施方案中，所述化合物可用于癌细胞可能离开原发部位的癌症的治疗方法。

在另一实施方案中，包括其等同物在内的上文所述化合物，可用于希望使癌细胞从部位移动到血流中并将癌细胞保留在血流中的癌症的治疗方法。

在另一实施方案中，包括其等同物在内的上文所述化合物，可用于将细胞(诸如造血干细胞)释放到循环血液中并增强所述细胞在血液中的保留的方法。

在另一实施方案中，包括其等同物在内的上文所述化合物，可用于疾病中发生细胞粘附或迁移的炎性疾病的治疗方法。

供以下实施例是为了举例说明，而并非限制。

实施例1 双靶向化合物C4的合成

如图1A内容所示，

化合物2的合成：可参照文献J.Med.Chem.1999,42,4909-4913,SynthesisandBiological Evaluation of a Potent E-SelectinAntagonist,G.Thoma,et al的内容进行制备。

化合物4的合成：将化合物3(0.9g)溶于甲醇(12ml)中，向该溶液中加入Bu

化合物8的合成：可参照文献J.Med.Chem.2007,50,1101-1115,Rational Designof Novel,Potent Small Molecule Pan-Selectin Antagonists,R.Kranich,et al.和Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 11(2001)923–925，SynthesisandBiological Evaluation ofa Sialyl Lewis X Mimicwith Significantly ImprovedE-selectin Inhibition，G.Thoma，et al的内容进行制备。

化合物10的合成：在0℃下，将Br

化合物11的合成：在室温和氮气下，取化合物4(3g)、化合物10(6g)和活化的粉末状分子筛4A在DCM(30mL)中混合搅拌2小时，然后在1小时时间内分四等分地加入DMTST(3g)，在室温下搅拌，持续搅24小时，用硅藻土过滤，用DCM(200ml)稀释，用盐水(2x50ml)洗涤，干燥合并得有机层(Na

如图1B内容所示，

化合物13的合成：向配制在DMSO(10ml)中的化合物12(1g)的溶液添加4-羟甲基苯甲醛(0.3g)、NaBH

化合物14的合成：将配制在DCM(3ml)中的(COCl)

如图1C内容所示，

化合物15的合成：在化合物11(100g)的DCM(200ml)溶液中加入三苯基膦(5g)和三丁基氢化锡(2g)，在室温下搅拌30分钟，再加入正三氟乙酰甘氨酸酐(22g)，继续搅拌。浓缩干燥，通过硅胶柱色谱纯化粗产物，从而得到化合物15(95g)。

化合物16的合成：向化合物15(10g)在甲醇-水(10：1，50mL)溶液中加入10％Pd-C(1g)，将反应混合物在氢气(30Psi)下室温搅拌24小时，用硅藻土过滤并将溶剂蒸除，得到化合物中间体(6g)，干燥后加入甲醇(80mL)和NaOMe的甲醇溶液(25％，0.5mL)，室温搅拌4小时，用乙酸中和至pH＝7，将溶剂蒸除，得到化合物16(5g)。

化合物17的合成：向化合物16(1g)在DCM溶液中加入二甲基氨，室温搅拌16小时，将溶剂蒸除，得到化合物中间体(1.1g)，向该中间体(1.1g)中加入乙二胺，加热搅拌5小时，将溶剂蒸除，通过SepadeG25柱得到化合物17(0.3g)。

化合物18的合成：向配制在DMSO(20ml)中的化合物14(5g)的溶液添加化合物17(7g)和NaBH

如图1D内容所示，

化合物19C的合成：将化合物19A(5g)和化合物19B(4.5g)溶解在CH

化合物19D的合成：向化合物19C(7g)在甲醇(100mL)溶液中加入NaOMe的甲醇溶液，室温条件下搅拌4小时，用醋酸中和至pH＝7,蒸发溶剂,得到化合物19D(4g)。

化合物19E的合成：将化合物19D(4g)溶在N,N-二甲基甲酰胺(50mL)中，加入吡啶-三氧化硫溶液(5-20mol/mol)，保持在-10℃下搅拌1小时，升温至室温后，降至-20℃，反应通过加入冷水(16mL)终止，用氢氧化钠溶液将pH值调至10.0，用乙醇(3体积)稀释，在0℃下放置2小时，得到白色沉淀19E(6g)。

化合物19F的合成：向化合物19E(6g)的甲醇-水(10：1，100mL)溶液中加入10％Pd-C(1g)，将反应混合物在氢气(30Psi)下室温搅拌24小时，用硅藻土过滤并将溶剂蒸除，得到化合物19F(5g)。

化合物19的合成：向化合物19F(5g)的DCM(50mL)溶液中加入二环己基碳二亚胺(DCC，4.5g)，三乙胺(3g)和N-羟基琥珀酰亚胺(2g)，将反应混合物在室温搅拌24小时，蒸发溶剂，通过柱色谱(硅胶)纯化残余物，得到化合物19(4.6g)。

如图1E内容所示，

化合物18A的合成：向化合物18(1g)的甲醇(10mL)溶液中加入NaOMe，将反应混物在室温搅拌4小时，蒸发溶剂，通过柱色谱(硅胶)纯化残余物，得到化合物18A(0.83g)。

化合物20的合成：向化合物18A(0.83g)的DCM(10mL)溶液中加入化合物19(1.2g)、二环己基碳二亚胺(DCC，0.5g)和三乙胺(0.3g)，将反应混合物在室温搅拌24小时，蒸发溶剂，通过柱色谱(硅胶)纯化残余物，得到化合物20(0.9g)，即双靶向化合物C4。

实施例2 评价化合物C4与CXCR4的结合的测定

该测定评价糖拟化合物抑制藻红蛋白("PE")偶联抗CXCR4抗体与SupTl细胞表面上的CXCR4结合的能力。SupTl细胞是源于淋巴母细胞性白血病的T淋巴母细胞，并且在细胞表面组成型表达CXCR4。该细胞购自ATCC(ATCC号：CRL-1942)。抗人CXCR4-藻红蛋白单克隆抗体(抗CXCR4-PE)购自R&DSystems(目录号：FAB170P、克隆12G5)。使细胞生长在补充了10％FBS的RPMI1640培养基中。通过将细胞以400g离心10分钟来洗涤约2x10

结果如下表所示，化合物C4以剂量依赖方式抑制抗CXCR4-PE与SupTl细胞的结合，IC

实施例3 E-选择蛋白活性-结合测定

筛选E-选择蛋白的糖模拟拮抗剂的抑制测定是竞争性结合测定，其允许测定IC

实施例4 P-选择蛋白活性-结合测定

具体步骤与实施例3大致相同，区别仅在于，筛选P-选择蛋白的糖模拟拮抗剂的抑制测定是竞争性结合测定，即在微量滴定板中固定P-选择蛋白/Ig嵌合体。

通过与实施例1相似的工艺可制备说明书前文提及的双靶向化合物C1、C2、C3、C5、C6和C7，各个化合物的测定结果如下表所示。

通过上述测定结果可知，本发明提供的实施例中，在E-选择蛋白结构的不同部位引入硫酸酯基团，以此使E-选择蛋白的活性提高10倍以上，使P-选择蛋白的活性提高100倍以上；同时由于E-/P-选择蛋白活性得以提高，本发明提供的实施例可以连接更高活性的CXCR4趋化因子受体抑制剂，提高了整个化合物的活性，降低最终药物的用药剂量。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。