L-FABP T94A基因突变体的构建及其在张氏肝细胞中表达及功能研究

摘要

背景：肝脏型脂肪酸结合蛋白(liver fatty acid binding protein，L-FABP)是脂肪结合蛋白超家族中的一员。FABP家族的主要功能是调节脂肪酸的吸收及其在细胞内的转运。L-FABP表达的组织特异性和配体结合的选择性提示其可能在肝脏的脂质代谢调控中发挥了重要作用。研究发现L-FABP基因序列94位存在一个丙氨酸替代苏氨酸(T94A)的突变位点，我们推测这种突变可能会改变肝脏脂质代谢。 目的：本研究旨建立L-FABP不同基因型的稳定表达细胞系，研究L-FABP基因T94A多态性对肝脏游离脂肪酸摄入及排出的影响。为阐明L-FABP在肝脏脂质代谢中的作用打下基础。 方法：采用PCR、RT-PCR、质粒构建、定点诱变、转化、转染等技术构建L-FABP野生型和突变型表达载体，并通过G418筛选构建稳定表达细胞系。采用Western Blot鉴定蛋白表达。采用免疫组化方法确定重组蛋白在细胞内的表达位置。通过采用液闪计数测量[3H]-油酸孵育不同时间点后细胞裂解液的放射性强度来反映肝细胞对游离脂肪酸的摄入能力。并通过[3H]-油酸孵育特定时间点后，测量不同时间点的脂质的排出量来反映肝细胞对游离脂肪酸的排出能力。 结果：本实验成功构建了L-FABP的野生型、突变型和空质粒的稳定表达细胞系。L-FABP重组蛋白大量表达于胞浆中，与正常生理表达一致。L-FABP与游离脂肪酸的摄入密切相关，转染L-FABP野生型的细胞对FFA的摄入较对照组显著增加；不同基因型对脂肪酸的摄入呈时间依赖型的增加，孵育至第60 min时，野生型，突变型，空质粒组及正常细胞组摄入的量分别为11.07±3.12，5.82±0.72，5.74±0.11，5.70±0.56 cmp×103/mg蛋白，野生型与突变型及对照组相比，游离脂肪酸的摄入量增加了约1倍(P<0.01)；而突变型、空质粒和正常细胞组两两间比较差异均没有显著性意义(P>0.05)。在排出实验中，孵育至第30 min野生型，突变型及空质粒组脂肪酸的相对排出率分别为48％±7％，42％±7％，33％±12％，三者并没有明显的差异(P>0.05)。 结论：本研究首次在细胞水平构建的L-FABP T94A稳定表达细胞模型可用于L-FABP突变的功能研究；高表达的L-FABP可以促进脂肪酸的摄入：L-FABP T94A的突变可降低肝脏细胞对游离脂肪酸的摄入。L-FABP的T94A突变对脂质的排出无显著影响。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第二章材料

1主要试剂和药品

2主要仪器

第三章方法

1野生型L-FABP的表达载体的构建

2突变型L-FABP的表达载体的构建

3不同基因型L-FABP稳定表达细胞系的建立

4转染细胞对[3H]-油酸的摄入及排出影响

5统计学处理

第四章结果

1L-FABP RNA提取及cDNA克隆

2L-FABP真核表达载体鉴定

3中间载体T-载体的构建

4定点诱变

5稳定细胞系的建立

7功能实验

第五章讨论

第六章结论

参考文献

综述 肝脏型脂酸结合蛋白与代谢综合征

致谢