肢体缺血再灌注大鼠脑组织中iNOS、nNOS、eNOS的mRNA表达及其意义

摘要

背景:肢体缺血再灌注损伤(LIRI)是临床中经常发生的病理过程，如断肢再植术、肢体外出血使用止血带、严重的挤压伤后、大血管栓塞再通或损伤修复等，均可造成以肢体损伤为中心的多脏器损伤，甚至多器官功能障碍，使肢体缺血再灌注损伤成为临床肢体血运重建后出现意外致残、致死的主要原因之一。肢体缺血再灌注造成远隔器官损伤的病理机制目前尚未明确，已证实中性粒细胞和氧自由基参与介导的炎症反应和氧化应激与此有重要关系。其中氧自由基既可以造成组织细胞的脂质过氧化，还可以引起一系列的炎症反应和细胞损伤，是一种非常重要的损伤因素。一氧化氮(NO)作为生物体内重要的信使分子和效应分子，是迄今发现的与炎症反应和氧化应激损伤密切相关的两个气体信使分子之一。体内NO的半衰期短，生物作用完全依赖一氧化氮合酶(NOS)，所以NOS是NO合成的关键酶。目前研究证实NOS-NO参与了肢体长时间缺血再灌注后的脑组织损伤过程，其中诱导型NOS(iNOS)有明显时间含量改变规律。是否神经元型NOS(nNOS)和内皮型NOS(eNOS)也存在如此的变化?目前国内外并未见相关研究文献。 目的:通过建立大鼠后肢缺血再灌注模型，观察脑组织形态结构变化，运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定脑组织中三种一氧化氮合酶亚型的时-量变化和通过比色法测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的时-量变化，最终支持长时间肢体缺血后再灌注血流对脑组织的不良影响，观察不同亚型的NOS在此过程中的时-量变化特点，探讨不同亚型NOS在氧化应激过程中的作用倾向。 方法:实验选用2月龄SD雄性大鼠56只，体重220.51～250.50g，平均226.90±8.44g，组间比较其差异无统计学意义。56只SD大鼠随机分为正常组、实验组： (1)正常组(N n=8)直接将大鼠用水合氯醛(5ml/kg)腹腔注射麻醉后，头顶相应区域剪毛，络合碘消毒，直接开颅剥离取出一侧大脑半球，超低温保存； (2)实验组(I/R n=48)建立双后肢缺血4小时模型后，再分为再灌注2小时、4小时、6小时、8小时、16小时和24小时6组，每组8只。麻醉后取一侧大脑半球，超低温保存。实验结束后，光镜下观察脑组织形态学改变，测定脑组织中iNOS、nNOS、eNOS各时间点的mRNA半定量表达和MDA含量、总SOD活性的变化，分析iNOS、nNOS、eNOS、MDA与SOD的相关性。 结果: 1、以各指标条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值作为iNOS、nNOS和eNOS的mRNA半定量结果。正常脑组织中有少量iNOS、nNOS和eNOS表达，缺血再灌注2小时后均出现表达增强，其中iNOS缺血再灌注4小时表达到高峰，nNOS、eNOS在缺血再灌注6小时后表达达高峰，三型NOS缺血再灌注24小时均再次出现高表达。实验结果以x±S表示，实验组各时间点结果与正常组比较，差异有显著性意义。 2、正常组和实验组各时间点比较，随缺血再灌注时间延长SOD活力显著降低，MDA含量则显著增高。SOD最低值出现在缺血再灌注4小时组，MDA最高值出现在缺血再灌注4小时组。与正常组比较，差异有显著性意义。 3、以脑组织总SOD活力为应变量，检验水准α=0.05(双侧)。脑组织总SOD活力与MDA含量(r=-0.475)，iNOS(r=-0.304)，nNOS(r=-0.415)，eNOS(r=-0.31)均呈显著负相关。 4、光镜下观察IR 4h、24h组，脑组织水肿，神经元受损最严重。大脑皮质部份神经元胞体、胞核增大，胞浆及核密度下降，部分神经元核仁消失；锥体细胞明显变小，着色加深，细胞周围出现水肿裂隙。 结论: 1、肢体缺血再灌注后，脑组织损伤的发生与氧化应激有直接关系。由MDA和SOD的时-量变化规律可证实，此氧化应激损伤在I/R 4h最严重。 2、NOS作为NO的关键酶，其三种亚型合酶在缺血再灌注的不同时间点，也存在不同的含量表达变化规律。其中iNOS的高表达时间早于nNOS和eNOS，且三种亚型NOS均有两个表达高峰，可认为肢体的缺血再灌注对脑组织的损伤以IR 4h和24h为损伤最重时期。 3、NOS的三种亚型合酶与机体抗氧化酶SOD呈现负相关，可认为三种亚型合酶在肢体缺血再灌注后的高表达可以加重氧化应激损伤，以nNOS最明显，eNOS其次。

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文摘

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第一章前言

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验观察指标及测试方法

2.4统计学处理

第三章结果

3.1肢体缺血再灌注后脑组织中iNOS、nNOS、eNOS的mRNA表达

3.2脑组织中MDA含量、总SOD活力测定结果

3.3脑组织中iNOS、nNOS、eNOS、MDA及SOD的相关性分析

3.4各实验组光镜结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

综述下肢缺血再灌注损伤及其对远隔器官影响的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章