shRNA介导的β-catenin基因沉默对食管癌细胞生物学行为的影响及其机制的研究

摘要

食管癌是人类最常见且预后较差的恶性肿瘤之一，全世界每年约30余万人死于食管癌。在我国，食管鳞状细胞癌(Esophagealsquamous cell carcinoma，ESCC)是较腺癌更为常见的组织学类型。近年来随着普查、手术治疗以及放化疗的综合应用，食管癌的预后有了很大的改善，但5年生存率仍不足10％。目前对食管癌发生的分子机制尚缺乏准确的理解，在治疗上仍找不到有效的靶向分子。因此，进一步深入研究食管癌的发病机制，寻找与其发生、发展密切相关的基因异常改变，并在此基础上发展新的治疗策略显得尤为重要。 Wnt信号通路在细胞分化、形态发生、肿瘤发生中具有重要作用。β-catenin是该通路的关键分子，它在细胞内主要有两方面的功能：一方面参与细胞之间的粘附；另一方面，β-catenin作为Wnt信号通路的关键分子，将信号导入细胞核而发挥效应。研究发现，在食管癌组织中存在着β-catenin的异常胞浆/核积累现象。胞浆积累的β-catenin可转位入核，通过与TCF/(T cell factor)/LEF(lymphoid enhancer factor)转录因子形成复合物而调控下游多种靶基因的表达，如c-jun、c-myc和cyclin D1等。因此，β-catenin的胞浆积累和转位入核在Wnt信号通路激活中起着至关重要的作用，其可作为食管癌治疗的一个潜在靶点。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发展起来的一种新技术，由于它能特异而有效地阻断靶基因的表达，目前被广泛应用于各种肿瘤的研究。我们构建了针对β-catenin的短发夹RNA(shortharpin RNA，shRNA)真核表达载体并首次转染人食管癌细胞Eca-109，观察抑制β-catenin表达对Eca-109细胞生长特性的影响，并对其机制作初步探讨。 目的：研究shRNA介导的β-catenin基因沉默对食管癌细胞生物学行为的影响及其机制，探讨β-catenin在食管癌发生、发展中的作用，为以β-catenin为靶的食管癌基因治疗提供理论和实验依据。 方法：通过细菌转化、酶切、凝胶电泳、基因测序鉴定和基因重组技术等方法构建针对β-catenin的RNAi质粒pGen-3-CTNNB1和阴性对照质粒pGen-3-con。利用脂质体介导转染技术转染人食管癌细胞Eca-109，经G418筛选得到稳定抑制β-catenin表达的食管癌细胞模型(pGen-3-CTNNB1细胞)；分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、细胞免疫荧光和Western blotting检测RNAi组(pGen-3-CTNNB1)、对照组(pGen-3-con)及未转染组(Eca-109)3组细胞中β-catenin的表达：通过MTT比色法和平板克隆形成实验检测3组细胞体外增殖能力；建立裸鼠皮下移植瘤模型，通过绘制肿瘤生长曲线、比较瘤重来观察抑制β-catenin表达在活体内对肿瘤细胞生长能力的影响；利用免疫组织化学检测移植瘤组织中β-catenin的表达水平，检验RNAi质粒对β-catenin表达的抑制效果。 采用流式细胞术检测3组细胞细胞周期和凋亡率的改变；RT-PCR、荧光定量PCR、Western blotting检测3组细胞中cyclinD1的表达水平；Western blotting检测3组细胞中PCNA、p-ERK的表达水平；透射电子显微镜观察抑制β-catenin表达对食管癌细胞Eca-109超微结构的影响；免疫细胞化学检测PCNA的表达，观察PCNA标记指数。 利用免疫组织化学技术检测65例食管鳞癌组织及20例正常食管粘膜中β-catenin的表达定位，分析其与临床病理学参数的关系；RT-PCR检测31例新鲜食管鳞癌及其正常食管粘膜组织中β-catenin mRNA的表达。 结果：限制性酶切及基因测序证实成功构建了针对β-catenin基因的RNAi载体pGen-3-CTNNB1；Western blotting及细胞免疫荧光证实在人食管癌细胞株Eca-109中存在β-catenin的异常胞浆/核积累；利用脂质体介导的基因转染技术将pGen-3.CTNNB1转染Eca-109细胞，经G418筛选，RT-PCR、Western blotting及细胞免疫荧光鉴定，成功建立了稳定抑制β-catenin基因表达的食管癌细胞模型。与对照组(pGen-3-con)和未转染组(Eca-109)比较，RNAi组(pGen-3-CTNNB1)细胞的增殖能力明显下降，形成的克隆数目少且体积小(P<0.05)；裸鼠移植瘤模型中，RNAi组移植瘤的体积和瘤体重量明显小于其它两组(P<0.05)，瘤组织中β-catenin的表达水平明显降低。流式细胞术结果表明：与其它两组比较，RNAi组细胞G0/G1期细胞百分比明显增加，S期细胞百分比明显减少(P<0.05)，而3组细胞的凋亡率之间无差异(P>0.05)。RT-PCR.、荧光定量PCR及Western blotting均表明：在RNAi组cyclinD1的表达下降：Western blotting证实RNAi组中PCNA和p-ERK的表达水平低于其它两组(P<0.05)。免疫细胞化学结果表明：RNAi组PCNA标记指数低于对照组和未转染组。透射电镜结果表明：RNAi组细胞核体积变小，皱缩，异染色质增多，细胞质增多，核浆比减小，线粒体和粗面内质网数量增多，粗面内质网甚至扩张成池，提示抑制β-catenin表达后，Eca-109细胞趋于成熟分化。 免疫组织化学结果显示：在20例正常食管粘膜组织中，β-catenin主要位于胞膜；在65例ESCC组织中，β-catenin的胞浆积累阳性率为63.1％，胞核积累阳性率为30.8％；β-catenin的胞浆/核积累与淋巴结转移相关(P=0.005)，但与患者的年龄、性别、肿瘤的分化程度及浸润深度等无关。RT-PCR结果显示：在3 1例ESCC组织及相应的正常食管粘膜组织中，均检测到β-catenin基因mRNA水平的表达。与相应的正常食管粘膜组织比较，表达升高的21例，占67.7％。 结论： 1.首次证明在人食管癌细胞Eca-109中存在β-catenin表达异常和Wnt信号通路的异常激活；成功构建了针对β-catenin基因的RNAi质粒pGen-3-CTNNB1，建立了稳定抑制β-catenin基因表达的食管癌细胞模型pGen-3-CTNNB1细胞。 2.成功建立稳定抑制β-catenin基因表达的裸鼠移植瘤模型，首次证明转染针对β-catenin基因的RNAi质粒载体可以在体内外抑制食管癌细胞的生长。 3.首次证明抑制β-catenin基因表达能够将人食管癌细胞Eta-109阻滞于细胞周期G0/G1期，并促进其分化成熟，部分逆转其恶性表型；Cyclin D1、PCNA等细胞周期调控因子及p-ERK可能参与了β-catenin基因沉默所导致的食管癌细胞Eta-109生长抑制作用。 4.在食管鳞状细胞癌中存在β-catenin蛋白的异常胞浆/胞核积累，并与淋巴结转移有关；在食管鳞状细胞癌中存在β-cateninmRNA表达水平的增加。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写注解

声明

技术路线

第一章shRNA介导的β-catenin基因沉默对食管癌细胞生物学行为的影响

前言

实验材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

1.3统计学处理

结果

讨论

小结

第二章β-catenin基因沉默抑制食管癌细胞增殖的机制研究

前言

实验材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3统计学处理

结果

讨论

小结

第三章β-catenin在食管鳞癌中的表达及其与临床病理参数的关系

前言

实验材料与方法

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3统计学处理

结果

讨论

小结

总结论

参考文献

综述 β-连环蛋白与食管癌

致谢

攻读博士学位期间的研究成果和荣誉