目的：构建靶向人骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因短发夹RNA(OPN-shRNA)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞增殖、黏附、侵袭能力及血管生成因子表达的影响.方法：以OPN为靶基因设计4对shRNA,分别命名为OPN-shRNA1-4及阴性对照NC-shRNA,连接入质粒pGPU6/GFP/Neo中,酶切及测序鉴定正确后转染LoVo细胞,通过Western blot和Real time RT-PCR检测LoVo细胞OPN的表达情况.筛选出沉默效率最佳的shRNA,观察其对LoVo细胞增殖、黏附和侵袭等生物学行为的影响;ELISA法检测OPN对LoVo细胞血管内皮生成因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)等血管生成因子表达的影响.结果：1.酶切及测序结果表明OPN-shRNA载体构建成功,Real time RT-PCR和Western blot结果显示OPN-shRNA4能明显抑制LoVo细胞中OPN mRNA和蛋白质表达.2.OPN-shRNA4组,LoVo细胞增殖24h、48h、72h、96h的A450值分别为(0.210±0.017)、(0.247±0.024)、(0.314±0.037)、(0.359±0.043);24h黏附于Fn的细胞A595值为(0.215±0.036);48h穿透Matrigel的细胞数为(16.1±1.9)个,均低于NC-shRNA组及正常LoVo组(P＜0.05).3.ELISA法测定OPN-shRNA4组、LoVo组和NC-shRNA组中VEGF含量分别为(1687.85±167.84、2348.54±143.80和2284.39±138.62ng/L)(P＜0.05),MMP-2(2966.07±177.36、4084.74±349.54和4011.41±424.48μg/L)(P＜0.05),MMP-9(3782.89±300.64、5062.90±303.02和4986.38±300.75μg/L)(P＜0.05),uPA(1152.69±120.79、1380.90±147.25和1449.80±189.92μg/L)(P＜0.05).结论：本课题组成功构建了OPN-shRNA的质粒表达载体,干扰序列OPN-shRNA4可通过抑制LoVo细胞OPN表达降低其增殖、黏附、侵袭能力及血管生成因子的表达.
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