Fractalkine在动脉粥样硬化发生中的作用及阿司匹林干预的实验研究

摘要

目的：探讨阿司匹林干预对肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激的人脐静脉内皮细胞(HUWEC)表达fractalkine(FKN或CX3CL1)的影响及其机制。 方法：将生长良好的人脐静脉内皮细胞随机分成以下8组(n=3)：①空白组：HUVEC；②TNFα刺激组：HUVEC+TNFα；③NS-398干预组：HUVEC+NS-398(0.5μmol/L)+TNFα；④)PDTC干预组：HUVEC+PDTC(40μmol/L)+TNFα；⑤⑥⑦⑧均为阿司匹林干预组，将分别予0.02mmol/L，0.2 mmol/L，1mmol/L和5mmol/L阿司匹林进行干预。除空白组和TNFα刺激组，其它6组HUVEC分别加入含上述浓度干预药物的RPMI1640培养基培养24小时，换液，空白组加入RPMI1640培养基，其它7组加入含4ng/mlTNFα的培养基再培养24小时。然后提取细胞总RNA，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞的FKN、环氧合酶(COX)-1、COX-2和核因子kappaB(NF-kappaB)p65mRNA表达；提取细胞膜蛋白、浆蛋白和核蛋白，采用蛋白印迹法检测各组细胞的FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65蛋白表达。单因素方差分析各组HUVEC表达的FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65 mRNA相对灰度值以及FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65的蛋白相对灰度值。 结果： 1.RT-PCR显示各组HUVEC表达的FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65电泳条带有强度区别。单因素方差分析显示： ①各组HUVEC表达的FKNmRNA差异有非常显著性意义。与空白组比较，4ng/mlTNFα使HUVEC的FKNmRNA明显增加。与TNFα刺激组比较，0.02mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度阿司匹林干预组HUVEC的FKNmRNA水平下降，并且呈浓度依赖性。与TNFα刺激组比较，40μmol/L PDTC干预使HUVEC的FKNmRNA水平明显下降，0.5μmol/L NS-398干预对FKNmRNA表达没有影响。 ②各组HUVEC表达的COX-1mRNA差异有非常显著性意义。4ng/mlTNFα刺激后HUVEC的COX-1 mRNA表达无明显变化，但是，与TNFα刺激组比较，0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林使HUVEC的COX-1mRNA水平表达下降，且呈浓度依赖性。0.02mmol/L阿司匹林、40μmol/L PDTC和0.5μmol/LNS-398干预对COX-1mRNA表达没有影响。 ③各组HUVEC表达的COX-2mRNA差异有非常显著性意义。与空白组比较，4ng/ml TNFα使HUVEC的COX-2 mRNA明显增加。与TNFα刺激组比较，0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林干预均使TNFα,诱导的COX-2mRNA水平下降，并且呈浓度依赖性。0.02mmol/L阿司匹林、40μmol/L PDTC干预对TNFα刺激的COX-2mRNA表达没有影响，而0.5μmol/LNS-398干预抑制TNFα刺激的COX-2mRNA表达。 ④各组HUVEC表达的NF-kappaB p65 mRNA差异有非常显著性意义。空白组与4ng/ml TNFα刺激组的NF-kappaB p65 mRNA表达没有差异，0.02mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林干预均使HUVEC的NF-kappaB p65 mRNA水平下降，40μmol/L PDTC干预抑制NF-kappaB p65 mRNA表达，而0.5μmol/L NS-398干预对NF-kappaB p65 mRNA表达没有影响。 2.Western blot显示各组HUVEC表达的FKN、COX-2和NF-kappaB p65蛋白有强度区别。单因素分析显示： ①各组HUVEC表达的FKN蛋白差异有非常显著性意义。与空白组比较，4ng/ml TNFα使HUVEC的FKN明显增加。与TNFα刺激组比较，0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林干预均使TNFα诱导的FKN蛋白水平下降，并且呈浓度依赖性。0.02mmol/L阿司匹林、0.5μmol/L NS-398干预对HUVEC的FKN蛋白表达没有影响。40μmol/L PDTC干预使HUVEC的FKN蛋白水平明显下降。 ②各组HUVEC表达的COX-1蛋白差异没有显著性意义。 ③各组HUVEC表达的COX-2蛋白差异有非常显著性意义。与空白组比较，4ng/ml TNFα使HUVEC的COX-2蛋白表达明显增加。与TNFα刺激组比较，0.02mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林干预使TNFα诱导的HUVEC的COX-2蛋白表达下降，并且呈浓度依赖性。0.5μmol/L NS-398和40μmol/LPDTC干预使COX-2蛋白表达明显下降。 ④各组HUVEC表达的NF-kappaB p65蛋白差异有非常显著性意义。空白组与4ng/ml TNFα刺激组的NF-kappaBp65蛋白表达没有差异，0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L浓度的阿司匹林干预均使HUVEC的NF-kappaBp65蛋白水平下降，40μmol/L PDTC干预抑制NF-kappaBp65蛋白表达，而0.02mmol/L、0.5μmol/L NS-398干预对NF-kappaB p65蛋白表达没有影响。 结论： ①TNFα(4ng/ml)通过活化NF-kappaBp65诱导人脐静脉内皮细胞FKN mRNA以及蛋白表达增加。 ②阿司匹林浓度依赖性地抑制TNFα诱导的FKNmRNA和蛋白表达，这一效应可能与阿司匹林抑制COX-1活性、NF-kappaBp65活化以及NF-kappaBp65表达有关。 ③TNFα(4ng/ml)通过活化NF-kappaBp65诱导人脐静脉内皮细胞COX-2mRNA以及蛋白表达增加。但是COX-2水平上调与TNFα诱导的FKN表达无关。阿司匹林浓度依赖性地抑制TNFα诱导的COX-2表达。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分人脐静脉内皮细胞的Fractalkine表达以及阿司匹林干预的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

总结

参考文献

第二部分ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块中FKN表达及阿司匹林的干预作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

总结

参考文献

综述 趋化因子fractalkine/CX3CR1与动脉粥样硬化

致谢

攻读学位期间主要研究成果