磁性纳米壳聚糖微球的制备及其固定化酵母细胞的研究

摘要

磁性高分子微球是指通过适当的方法使有机高分子与无机磁性物质结合起来形成具有一定磁性和特殊结构的微球。它除了具有磁性还具有高分子的特性，微球表面能引入多种活性基团来结合酶、细胞、抗体等生物活性物质，在细胞快速分离、酶/细胞固定、靶向药物等方面有着广阔的应用前景。固定化技术由于能保持酶/细胞的活性和重复利用等特点而倍受众多研究者的关注。固定化过程的关键因素是固定化载体设计和制备以及固定化方法的选择。光学活性的扁桃酸是一种多用途的手性试剂，同时又是合成青霉素和头孢菌素的药物中间体。因此，制备手性扁桃酸成为合成化学中一个富有挑战性的目标。而采用酵母细胞生物催化制备手性扁桃酸，因其具有高效率，高立体选择性，反应条件温和以及经济和社会效益好等优点而倍受青睐。 基于此，本论文主要以面包酵母为生物催化剂，选择合适的固定化载体和固定化方法固定酵母微生物，生物催化合成(R)-扁桃酸。以磁性纳米Fe3O4为核，通过壳聚糖(CTS)和α-酮戊二酸缩壳聚糖(KCTS)的包覆，合成了两种纳米磁性壳聚糖高分子微球，并将壳聚糖和合成的磁性壳聚糖高分子微球作为固定化酵母醇脱氢酶(Saccharomvces cerevisiae alcohol dehydrogenase (SCAD))和酵母细胞的载体，进而作为生物催化剂催化潜手性底物苯乙酮酸合成(R)-扁桃酸。主要研究工作如下： 采用氧化水热法，以H2O2为氧化剂制备了纳米Fe3O4颗粒，并对Fe3O4颗粒表面进行改性。以磁性Fe3O4为核，通过反相悬浮交联法，与CTS聚合制备了表面含有氨基的磁性Fe3O4/CTS纳米粒子。以磁性Fe3O4为核，在碳二亚胺的活化作用下，通过反相悬浮交联法与KCTS反应制备了表面含有羧基的磁性Fe3O4/KCTS纳米粒子。经XRD、TEM、VSM、IR、TGA等手段对复合材料进行了表征。结果表明：氧化水热法制备的Fe3O4粒子具有尖晶石型结构，平均粒径为23 nm；磁性Fe3O4/CTS粒子平均粒径为35 nm，其饱和磁化强度为21.5 emu·g-1；磁性Fe3O4/KCTS微球的平均粒径为26nm左右，比饱和磁化强度为24.8emu·g-1；此两种磁性复合纳米粒子具有超顺磁性和良好的磁分离效果。 以苯乙酮为起始原料，经亚硝化、水解和氧化得潜手性底物苯乙酮酸。此方法缩短了反应步骤，操作简单，收率为57.5％。同时研究了一种快速定量分析发酵液中苯乙酮酸的方法，即在氢氧化钠的水溶液中，苯乙酮酸和2,4-二硝基苯肼在碱性条件下形成一种红棕色的溶液，该溶液在458 nm处有最大吸收。苯乙酮酸的量在0.01-0.05mmol/L范围内符合朗伯-比耳定律，回归方程 Y=13.512X-0.01212.R=0.9994。故可以用它快速检测发酵液中苯乙酮酸的消耗量，从而可以迅速了解反应进程。 以酿酒酵母为研究对象，通过增殖培养、超声波破碎酵母菌细胞获得SCAD。采用溶胀-吸附法，将SCAD在25℃，吸附在磁性纳米Fe3O4/KCTS粒子，固定60 min，此时SCAD的吸附率为24.87％。以苯乙酮酸为底物，对磁性纳米Fe3O4/KCTS粒子固定化SCAD的酶学性质进行了研究。固定化酶的最适温度为20℃，最佳反应pH值是7.4，固定化酶具有良好的热稳定性和pH稳定性，在70℃保温1h保持53.5％的酶活力；在pH6.4-8.0之间均能保持最大活力的80％以上。 利用吸附体系研究了SCAD与磁性纳米Fe3O4/CTS载体的吸附行为，评价了SCAD在磁性纳米Fe3O4/CTS载体上的吸附能力，探讨了磁性纳米Fe3O4/CTS载体对SCAD的吸附动力学和热力学行为。磁性纳米Fe3O4/CTS载体对SCAD的吸附在所研究的SCAD浓度范围内符合Freundlich模型。磁性纳米Fe3O4/CTS载体对SCAD吸附反应符合Lagergren一级反应动力学模型，在293K时，速率常数k为0.01254 min-1。吸附表观活化能Ea为27.62kJ·mol-1，活化能比较低，表明纳米Fe3O4/CTS载体对SCAD的吸附较容易。在起始酶液浓度为0.1435-0.9162mg·ml-1范围内，ΔH为正值，表明这是一个吸热反应，升高温度有利于吸附的进行。以苯乙酮酸为底物，对磁性纳米Fe3O4/CTS粒子固定化SCAD的酶学性质进行了研究。固定化酶的最适温度为40℃，最佳反应pH值是7.4，固定化酶具有良好的热稳定性和pH稳定性。磁性酶因具有磁响应性，可方便、快速地从反应体系中分离。 SCAD以NADH为辅酶催化苯乙酮酸转化为(R)-扁桃酸的反应属于双底物酶促反应，遵循有序反应机理。反应机理是：辅酶分子A(NADH)先进入酶的辅酶结合部位，形成EA后底物苯乙酮酸B再进入底物结合部位，形成三元活性配合物EAB，完成氧化还原反应变成EPQ配合物，再按顺序释出产物P((R)-扁桃酸)和还原形式的辅酶Q(NAD+)。按King-Altman处理方式，在不考虑其它成分的抑制作用，得到了一个简化的酶促动力学方程。 v=Vmax[S]/Km+[S]利用Lineweaver-Burk双倒数法，研究了磁性纳米Fe3O4/CTS粒子固定化SCAD和纳米Fe3O4/KCTS粒子固定化SCAD的酶促动力学常数Km和Vmax。 以戊二醛为交联剂，将壳聚糖球交联引入醛基，然后将交联的壳聚糖球浸泡在酵母细胞悬浮液中，制备了固定化酵母细胞壳聚糖球。以苯乙酮酸为底物，催化合成了(R)-扁桃酸。最优固定化条件是戊二醛的质量分数w(GA)为1％，酵母细胞与交联壳聚糖球的质量比(m(Y)：m(CB))为0.5:1，交联时间为6h，固定化时间为18h，底物浓度为10 mmol·L-1，在此条件下反应最大转化率和产物光学纯度分别高达67.86％和98.05％e.e.。固定化酵母壳聚糖球具有良好的重复使用性和贮存稳定性。 利用磁性纳米Fe3O4/CTS微球作载体固定化酵母细胞，酵母细胞主要以吸附的形式固定在磁性壳聚糖上面，形成磁性固定化酵母细胞。在温度为30℃，时间为2h，磁性壳聚糖与菌泥质量配比为2:1时，酵母细胞吸附率可达17.2％。磁性固定化酵母细胞催化苯乙酮酸合成(R)-扁桃酸的最佳温度为30℃，时间为11h，底物苯乙酮酸的最佳浓度为10 mmol·L-1，转化培养基的最适pH为6.0，此时转化率可达29.3％，(R)-扁桃酸的e.e.为86.69％。磁性固定化细胞催化反应的活性优于游离细胞，且有一定的储存稳定性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1引言

1.2微生物催化的研究进展

1.2.1微生物转化反应的特点

1.2.2微生物催化反应中的研究方法

1.2.3微生物催化反应中的微生物

1.3固定化技术的研究进展

1.3.1固定化技术概况

1.3.2固定化酶或细胞的载体

1.3.3固定化方法

1.4磁性高分子微球的研究进展

1.4.1磁性高分子微球概况

1.4.2磁性高分子微球在生物医学领域的应用概述

1.5本课题研究的意义及内容

第二章H2O2氧化水热法制备磁性Fe3O4纳米颗粒

2.1引言

2.2实验原理

2.3实验部分

2.3.1实验仪器及试剂

2.3.2磁性Fe3O4的制备

2.3.3样品的结构分析与性能测试

2.4结果与讨论

2.4.1反应温度对Fe3O4粒径的影响

2.4.2反应温度对Fe3O4磁性能的影响

2.4.3反应时间对Fe3O4粒径的影响

2.4.4反应时间对Fe3O4磁性能的影响

2.4.5氨水量(pH)对Fe3O4粒径的影响

2.4.6双氧水用量对Fe3O4颗粒磁性能的影响

2.4.7磁性Fe3O4纳米颗粒的表征

2.5本章小结

第三章磁性Fe3O4/CTS和Fe3O4/KCTS复合微球的制备与表征

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1实验仪器及试剂

3.2.2磁性Fe3O4/CTS复合微球的制备

3.2.3磁性Fe3O4/KCTS微球的制备

3.2.4样品的结构分析与性能测试

3.3磁性Fe3O4/CTS粒子的表征

3.3.1 CTS和Fe3O4的质量比对磁性Fe3O4/CTS粒子的影响

3.3.2磁性Fe3O4/CTS粒子的红外光谱分析(FTIR)

3.3.3磁性Fe3O4/CTS粒子的X射线粉末衍射分析(XRD)

3.3.4磁性Fe3O4/CTS粒子的形貌及粒径分析

3.3.5磁性Fe3O4/CTS粒子的热分析

3.3.6磁性Fe3O4/CTS粒子的磁性能分析

3.4磁性Fe3O4/KCTS粒子的表征

3.4.1磁性Fe3O4/KCTS纳米微球的形貌及粒径分析

3.4.2磁性Fe3O4/KCTS纳米微球的红外光谱及形成机理分析

3.4.3磁性Fe3O4/KCTS纳米微球的X射线衍射分析(XRD)

3.4.4磁性Fe3O4/KCTS纳米微球的热分析

3.4.5磁性Fe3O4/KCTS微球的磁性能分析

3.4.6磁性Fe3O4/KCTS微球的稳定性研究

3.5本章小结

第四章苯乙酮酸的合成和分析

4.1引言

4.2苯乙酮酸的合成

4.2.1主要试剂以及仪器

4.2.2合成路线

4.2.3合成方法

4.2.4结果与讨论

4.3苯乙酮酸的含量分析

4.3.1主要仪器与试剂

4.3.2实验方法

4.3.3结果与讨论

4.4本章小结

第五章磁性纳米Fe3O4/KCTS微球固定化酵母醇脱氢酶的研究

5.1引言

5.2实验原理

5.3实验部分

5.3.1主要试剂以及仪器

5.3.2酵母菌株的培养和酵母醇脱氢酶的制备

5.3.3粗酶液中蛋白质含量的测量

5.3.4酵母醇脱氢酶的固定化

5.3.5酵母醇脱氢酶相对酶活力的测定

5.4磁性纳米Fe3O4/KCTS粒子固定化SCAD的结果与讨论

5.4.1吸附动力学

5.4.2磁性纳米Fe3O4/KCTS粒子固定化SCAD的TEM分析

5.4.3磁性纳米Fe3O4/KCTS粒子固定化SCAD酶学性质的研究

5.5固定化酵母醇脱氢酶的酶促动力学

5.5.1酶促反应动力学模型的建立

5.5.2动力学模型的推导

5.5.3酶促反应动力学常数的求测和意义

5.5.4磁性纳米Fe3O4/KCTS粒子固定化SCAD的酶促动力学研究

5.6本章小结

第六章磁性纳米Fe3O4/CTS微球固定化酵母醇脱氢酶的研究

6.1引言

6.2实验部分

6.2.1主要试剂以及仪器

6.2.2酵母菌株的培养和酵母醇脱氢酶的制备

6.2.3酵母醇脱氢酶的固定化

6.2.4酵母醇脱氢酶相对酶活力的测定

6.3结果与讨论

6.3.1影响SCAD吸附量的各种因素

6.3.2吸附等温线

6.3.3吸附动力学的研究

6.3.4吸附热力学的研究

6.3.5磁性纳米Fe3O4/CTS粒子对SCAD吸附的红外光谱分析

6.3.6固定化SCAD的TEM图

6.3.7磁性纳米Fe3O4/CTS粒子固定化SCAD的酶学性质

6.3.8磁性纳米Fe3O4/CTS粒子固定化SCAD的酶促动力学研究

6.4本章小结

第七章磁性壳聚糖微球固定化酵母细胞的研究

7.1引言

7.2实验部分

7.2.1主要试剂以及仪器

7.2.2球形壳聚糖微球固定化酵母细胞的实验方法

7.2.3磁性纳米Fe3O4/CTS微球固定化酵母细胞的实验方法

7.2.4磁性纳米Fe3O4/CTS微球固定化酵母细胞的效果分析

7.2.5苯乙酮酸的转化率η测定

7.2.6手性扁桃酸的分析方法

7.3球形壳聚糖微球固定化酵母的结果与讨论

7.3.1交联壳聚糖球及其固定化细胞小球的红外光谱分析

7.3.2交联壳聚糖球固定化酵母细胞的条件优选

7.3.3固定化酵母细胞催化还原苯乙酮酸合成(R)-扁桃酸的因素分析

7.3.4游离细胞和固定化细胞催化苯乙酮酸不对称还原反应过程比较

7.3.5固定化细胞的稳定性

7.3.6 小结

7.4磁性纳米Fe3O4/CTS微球固定化酵母细胞的结果与讨论

7.4.1磁性纳米Fe3O4/CTS微球固定化酵母的最佳条件

7.4.2固定化前后的细胞观察

7.4.3磁性纳米Fe3O4/CTS与固定化细胞的磁性Fe3O4/CTS微球的红外光谱分析

7.4.4固定化酵母细胞催化还原反应的最佳条件

7.4.5游离细胞和磁性固定化细胞催化苯乙酮酸不对称还原反应比较

7.4.6固定化细胞的稳定性

7.5本章小结

第八章结论与展望

8.1主要结论

8.2主要创新点

8.3对将来工作的展望

参考文献

致谢

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