磁性壳聚糖微球固定化酶酶解芝麻饼粕蛋白制备ACE抑制肽的研究

摘要

本文以固定酶酶解芝麻饼粕蛋白制备ACE抑制肽为研究课题，对酶解芝麻饼粕蛋白常用蛋白酶进行了筛选，通过单因素实验研究了制备磁性壳聚糖微球固定化Alcalase碱性蛋白酶的最佳工艺，通过响应面优化确定固定酶酶解芝麻饼粕蛋白制备ACE抑制肽的最佳酶解条件，最后采用超滤和葡聚糖凝胶层析对ACE抑制肽进行分离纯化。
　　以自制芝麻饼粕蛋白为底物，以水解度和短肽生成率为评价指标，在各种酶推荐的最适酶解条件下比较Alcalase碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、2709碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、Nuetrase中性蛋白酶六种常用蛋白酶酶解芝麻饼粕蛋白制备芝麻多肽的能力，并分析多肽的ACE抑制活性。研究发现:在相同底物浓度和加酶量条件下，Alcalase水解产生的芝麻多肽产率最高且水解度也较高。且由Alcalase碱性蛋白酶酶解所产生多肽的ACE抑制活性最强，2.5 mg/mL的多肽溶液的ACE抑制率为（67.42±1.75）％。
　　使用自制磁性壳聚糖微球载体固定化Alcalase碱性蛋白酶，考察给酶量、pH、戊二醛浓度以及交联时间对固定化Alcalase碱性蛋白酶酶活和酶活回收率的影响，并研究该固定化酶的酶学性质和微观结构。结果表明制备磁性壳聚糖微球固定化Alcalase碱性蛋白酶的最佳条件:给酶量112000 u/g载体，pH8.5，戊二醛浓度8％，交联时间11h，在此条件下酶活达最高86779 u/g，酶活回收率达77.48％。该固定酶和游离酶的最适pH分别为11和10.5，最适温度皆为60℃，且酶经固定后pH和温度稳定性都明显高于游离酶;重复使用固定酶5次后酶活保持80.89％;比较固定酶和游离酶米氏常数可知，固定酶具有更强的底物亲和力;透射电镜显示Fe3O4磁核和磁性壳聚糖微球皆为表面光滑球形的纳米级粒子，高比表面积能提供更多酶结合位点;通过红外光谱分析正明Fe3O4已被壳聚糖包埋，经振动样品磁强计检测后发现，本实验所制得固定化酶具有良好磁响应性。
　　使用磁性壳聚糖微球固定化Alcalase碱性蛋白酶酶解芝麻饼粕蛋白，通过单因素试验及响应面优化实验，利用Design-Expert8.05软件对实验数据进行分析拟合后得到有效数学模型，并通过计算得到最佳工艺条件:加酶量7105.03 u/g蛋白、温度59℃、pH10.96、酶解时间4.3 h，此时短肽生成率和ACE抑制率分别为86.35％和65.5％。
　　最后通过超滤和葡聚糖G-15凝胶层析对制得的ACE抑制肽进行进一步纯化。通过5KD超滤膜超滤后短肽含量达73.85％，较超滤前略有提高。采用葡聚糖G-15凝胶层析脱盐后，回收后各组分IC50值较纯化前有明显降低，其中组分Ⅱ IC50值最低（1.624 mg/mL），表明该组分ACE抑制活性最高。经过凝胶层析后，短肽含量比脱盐前明显提高，各组分脱盐率皆在80％以上，短肽回收率为63.85％。以上结果表明:采用超滤和G-15层析的初步分离芝麻蛋白水解物具有较好分离效果。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 芝麻饼粕研究价值

1．1．1 芝麻的营养价值

1．1．2 芝麻饼粕营养价值

1．1．3 芝麻饼粕的应用

1．2 制备多肽常用蛋白酶的简介

1．2．1 植物蛋白酶

1．2．2 动物蛋白酶

1．2．3 微生物蛋白酶

1．3 固定化酶的研究进展

1．3．1 固定化酶的应用

1．3．2 酶固定化方法

1．4 ACE抑制肽的研究进展

1．4．1 血管紧张素转移酶(ACE)与高血压

1．4．2 食源性ACE抑制肽

1．4．3 ACE抑制肽的构效关系

1．4．4 ACE抑制肽抑制活性的评价方法

1．5 立题背景与意义

1．6 本论文的主要研究内容

第二章 制备ACE芝麻肽的蛋白酶筛选

2．1 前言

2．2 材料、试剂及仪器

2．2．1 主要实验材料与试剂

2．2．2 仪器与设备

2．3 实验内容和方法

2．3．1 芝麻饼粕蛋白基本成分测定

2．3．2 酶活力的测定

2．3．3 芝麻蛋白的水解及其酶解产生多肽的制备

2．3．4 芝麻多肽ACE抑制活性的评价

2．4 结果与分析

2．4．1 测定自制芝麻饼粕蛋白基本成分

2．4．2 蛋白酶活力测定(福林酚法)

2．4．3 六种蛋白酶酶解芝麻饼粕蛋白水解度和短肽生成率的比较

2．4．4 六种芝麻多肽ACE抑制活性的评价

2．3 结论

第三章 磁性壳聚糖微球固定化Alcalase碱性蛋白酶的制备及酶学性质的研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料与试剂

3．2．2 仪器与设备

3．2．3 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 固定化酶的制备与影响因素

3．3．4 固定化酶酶学性质的研究

3．3．5 粒子表征

3．4 结论

第四章 磁性壳聚糖固定化Alcalase碱性蛋白酶酶解芝麻饼粕蛋白制备ACE抑制肽的研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料与试剂

4．2．2 仪器与设备

4．2．3 实验方法

4．3 结果和分析

4．3．1 固定化酶酶解芝麻饼粕蛋白制备ACE抑制肽的单因素实验

4．3．2 响应面优化酶解条件

4．4 本章小结

第五章 芝麻ACE抑制肽的分离纯化及活性研究

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 材料与试剂

5．2．2 仪器与设备

5．2．3 试验方法

5．3 结果与分析

5．3．1 超滤及结果分析

5．3．2 葡聚糖G-15凝胶层析后各组分分析

5．3．2 纯化效果评价

5．4 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 全文总结

6．2 创新点及工作展望

参考文献