Mcl-1在胆盐(GCDA)诱导的肝癌细胞存活与耐药中的作用及机制研究

摘要

目的： 研究肝细胞癌、癌旁及正常肝组织中Mcl-1的表达及其临床意义，探讨RNA干扰下调Mcl-1对肝癌细胞生长与药物敏感性的影响，通过研究GCDA对肝癌细胞存活与耐药的作用和可能途径，阐明抗凋亡蛋白Mcl-1在肝细胞癌发生中的作用，分析GCDA调节Mcl-1产生抗凋亡作用的机制，以利于进一步研究新的策略联合靶向Mcl-1，开发肝细胞癌治疗的新方法，开创肿瘤分子靶向治疗的新途径。 方法： 1.采用免疫组化S-P法检测51例肝细胞癌组织、49例癌旁组织和25例正常肝组织中Mcl-1的表达，并结合临床病理特征进行分析。 2.采用免疫荧光法检测GCDA作用前后细胞内蛋白表达强度与细胞内定位的变化。 3.用阳离子脂质体LipofectamineTM2000为载体将Mcl-1siRNA转染至HepG2细胞中，对细胞内Mcl-1基因表达进行干扰。 4.采用MTT法检测GCDA±抗肿瘤药物或抗肿瘤药物±Mcl-1siRNA处理前后肝癌细胞的相对活性与增殖性。 5.采用流式细胞分析法检测抗肿瘤药、GCDA或Mcl-1siRNA作用前后细胞周期的变化。 6.GCDA±抗肿瘤药物或抗肿瘤药物±Mcl-1siRNA处理肝癌细胞，AnnexinV-FITC和PI合染细胞，荧光显微镜和电镜观察凋亡形态学改变，流式细胞分析法检测细胞凋亡率的变化。 7.采用免疫沉淀法检测GCDA作用下Mcl-1与促凋亡蛋白间的相互结合。 8.提取各方案的细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，WesternBlotting技术检测细胞内待测蛋白的表达变化，β-Tubulin为内参，蛋白带灰度值采用BandScan软件进行分析。 9.采用CometAssay在单细胞水平上检测GCDA作用后DNA链损伤的情况。 结果： 1.抗凋亡蛋白Mcl-1在肝细胞癌组织和癌旁组织中均有表达，阳性率分别为68.63％和58.10％，与正常肝组织的8.00％相比，差异具有显著性（p<0.01）。细胞内定位以胞浆为主，部分出现胞核表达。其表达与临床病理特征如性别、年龄、HBV感染、肿瘤大小、肝硬化及病理分级无相关性（p>0.05），高分化肝细胞癌有较高的阳性表达率（67.86％）。 2.RNA干扰结果显示Mcl-1siRNA转染24h、48h、72h后Mcl-1蛋白表达明显减少，与未转染组有明显差异（p<0.01），尤以48小时表达最弱，其灰度值仅为未转染时的27.70％。Mcl-1下调后HepG2细胞中抗凋亡蛋白Bcl-xl表达相应减少，而促凋亡蛋白Bak、Bim和Bax表达稍有增多。 3.MTT结果显示GCDA在短时间内对肝癌细胞株HepG2细胞有增殖作用，以10～20min最明显（p<0.05）；其浓度在200μM内对细胞有增殖作用，以50～200μM处最明显（p<0.05）。RNA干扰下调Mcl-1后HepG2细胞在抗肿瘤药物作用下的存活率明显低于单纯药物组的存活率（P<0.05）。 4.流式细胞仪检测结果显示GCDA与转染载体本身对细胞周期与凋亡无明显影响（p>0.05），RNA干扰下调Mcl-1后HepG2细胞在药物作用下的凋亡率（33.17％）高于单纯药物组的凋亡率（17.60％）（P<0.05）。 5.免疫荧光结果显示GCDA能使细胞内Mcl-1和pERK表达明显增强，核内表达逐渐加强。Irinotecan处理后pERK和Mcl-1的表达稍有减弱，尤以核内明显。 6.免疫沉淀结果显示GCDA作用后Bak与Bim结合减少，Bim、Bak与Mcl-1结合增加。 7.WesternBlotting结果显示GCDA能使HepG2细胞中抗凋亡蛋白Mcl-1表达明显增加，促凋亡蛋白Bim、Bak和Bax表达减少。蛋白合成抑制剂使Mcl-1表达在2-3小时开始衰减，在GCDA存在情况下，Mcl-1在6小时的表达仍很强。Irinotecan处理后pERK和Mcl-1的表达被抑制，在GCDA存在情况下两者表达明显回升。 8.CometAssay检测结果显示随着GCDA作用浓度的增加HepG2细胞中DNA链损伤程度加重。WesternBlotting显示DNA修复蛋白PARP明显增强。 结论： 1.抗凋亡蛋白Mcl-1在肝细胞癌组织中呈过表达状态，在肿瘤发生过程中呈逐渐增强的趋势，高分化肝细胞癌就有较高的阳性表达率，提示肝细胞癌的发生与Mcl-1的抗凋亡作用有关。 2.RNA干扰能有效降低肝癌细胞中Mcl-1蛋白表达水平，Mcl-1蛋白的特异性下调能增加化疗药物作用后肝癌细胞的凋亡率，增强肝癌细胞的药物敏感性。当Mcl-1蛋白水平下调后，与Mcl-1同源的Bcl-2家族抗凋亡成员的功能受到部分抑制，促凋亡蛋白Bax、Bim和Bak功能增强，诱导细胞凋亡。 3.GCDA能诱导肝细胞癌细胞存活与耐药，其作用可能是通过上调抗凋亡蛋白和下调促凋亡蛋白来实现的。 4.GCDA能使肝细胞癌细胞中Mcl-1蛋白表达增强，并阻止Mcl-1在细胞内的降解，增加Mcl-1蛋白在细胞内的稳定性和抗凋亡作用。其机制是通过激活MAPK/ERK1/2信号通道，使ERK磷酸化并向细胞核内转运，激活靶蛋白Mcl-1产生抗凋亡作用。GCDA还能促进Mcl-1中和促凋亡蛋白Bim、Bak的作用使其失活，并减少Bim和Bak的相互结合，阻止细胞色素C的释放，抑制细胞凋亡。 5.GCDA作用下存在DNA的损伤与修复，为下一步研究打下了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词简表

声明

第一部分 抗凋亡蛋白Mcl-1在肝癌组织和肝癌细胞株中的表达及意义

1.1前言

1.2材料和方法

1.3结果

1.4讨论

1.5小结

第二部分 RNA干扰下调Mcl-1对肝癌细胞生长与药物敏感性的影响

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果

2.4讨论

2.5小结

第三部分 GCDA作用下肝癌细胞存活与耐药的实验研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果

3.4讨论

3.5小结

第四部分 GCDA调节Mcl-1产生抗凋亡作用的机制研究

4.1引言

4.2材料和方法

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

结论

参考文献

综述一 Mcl-1基因与肝细胞癌

综述二 肝细胞癌治疗药物研究进展

致谢

攻读博士学位期间主要的研究成果