日本血吸虫感染小鼠肝肠组织中AKP、钙化物以及PDI和ATPase的表达研究

摘要

目的：
　　 1.采用碱性磷酸酶(AKP)与钙化物染色方法，检测二者在日本血吸虫(Sj)感染小鼠吡喹酮常规治疗前后不同时间点肝脏、结肠组织虫卵的阳性水平，以期作为判别组织中虫卵死与活的标志物，为临床血吸虫病疗效考察提供实验依据。
　　 2.通过检测Sj感染小鼠治疗前后肝脏、结肠组织中PDI和ATPase的表达水平，观察不同分期肝脏、结肠组织病理损害程度，以期为评估血吸虫病预后提供有效指标。
　　 方法：
　　 1.建立Sj感染后和治疗后不同时间点的小鼠模型，取63只健康清洁级昆明小鼠，除正常对照组(N)9只外，其他按常规经腹部皮肤感染Sj尾蚴，感染后第45d随机分为6组:感染后45d、90d、120d三个不同时点各1组（即I45d、I90d、I120d）和在感染后第45d用吡喹酮300mg/kg.d×2次治疗后1M、2M和3M三个不同时点各1组（即T1M、T2M和T3M组）。各模型鼠在解剖时均做灌注冲虫，查获肠系膜静脉内虫体存活情况。取各组小鼠肝脏与结肠黏膜，作冰冻切片和石蜡包埋切片。
　　 2.用偶氮偶联法和NBT/BCIP两种AKP染色方法及VON KOSSA染色法对肝肠组织切片中虫卵进行比较观察，计数显色和不显色的虫卵数，依据虫卵显色阳性率，比较分析三种染色法对血吸虫死卵和活卵鉴定的效果。
　　 3.用常规HE和Masson染色法比较观察各组小鼠肝肠组织病变差异;用免疫组化法检测各组小鼠肝和结肠病变组织中PDI与ATPase表达水平，比较分析其在肝与肠二者间的相关性以及在治疗前后的动态变化规律。
　　 结果：
　　 1.各组模型鼠体内血吸虫虫体检测发现:在各组感染小鼠体内均可见数量不等雌雄合抱的活虫体，在各组治疗小鼠体内则均未观察到活虫体。
　　 2.肝肠组织切片中虫卵AKP染色结果显示:在感染后45d组，两种方法检测两种切片中虫卵阳性率均在95％以上，用偶氮偶联法和NBT/BCIP两种AKP染色法及VON KOSSA染色法对肝肠组织切片中虫卵进行比较检测观察，计数显色和不显色的虫卵数，依据虫卵显色阳性率，比较分析三种染色法对血吸虫死卵和活卵鉴定的效果。感染后120d组，其阳性率显著减低，在治疗鼠中，T2M和T3M两组肠黏膜内虫卵阳性率降为0，但肝组织内仍有阳性卵，并在T3M组仍有1.4％-5.29％的阳性率;AKP两种方法在检测虫卵总体效果上差异无显著性(p＞0.05)，在肝和肠二者间（阳性率）呈正相关性（秩相关系数为0.876，相关系数检验p＜0.01），但在结肠黏膜中检出的阳性虫卵率(49.12％-75.45％)普遍要高于肝组织内的(30.48％-49.92％)，其差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　 3.肝和肠组织切片中虫卵钙化物检测结果显示:在I45d组均未见钙化显色卵，I90d和I120d两组的虫卵钙化率分别为48％和45％（肠）及51％和62％（肝）;在T1M、T2M和T3M组中，虫卵钙化率分别为45％、95％和95％（肠）及22％、86％和96％（肝）;各组虫卵钙化率在肝和肠二者间呈正相关，（相关系数为0.841，p＜0.05），但在T3M鼠组织中仍然存在极少数未钙化卵。
　　 4.感染45d小鼠肝肠组织内仅有少量胶原沉积，随感染后时间延长，胶原范围增大，主要分布于虫卵周围与肝板间。在感染45d经吡喹酮有效杀虫后的小鼠肝肠组织可见明显的胶原沉积。
　　 5.与N组比，肝组织中感染组和治疗组PDI水平与N均表达增高，其中在I90d组表达水平为最高，(与其他各组比，差异有显著性，p＜0.05);治疗组PDI表达量下降，与感染各组比，其差异有显著性降低。结肠黏膜内PDI表达水平，与正常组相比，各组PDI表达均增高，其中I90d组和I120d组的表达水平较其他各组均显著增高(p＜0.05);治疗组PDI表达量与I90d组和120d组比，有显著下降(p＜0.05)。PDI表达水平在各模型鼠的肝和肠二者间有相关性(pearson相关系数为0.377，相关系数检验p＜0.05)。
　　 6.肝肠组织中ATPase表达主要分布于虫卵结节周围与内部，其活性水平在感染各组和T1M组中均增高，与T2M和T3M及N三组比，其差异有显著性(p＜0.05)。T2M和T3M与正常鼠之间ATPase表达差异无显著性(p＞0.05)。ATPase表达水平在各模型鼠的肝和肠二者间也有相关性(pearson相关系数为0.509，相关系数检验p＜0.05)。
　　 结论：
　　 对Sj感染45d鼠作病原有效治疗后，仍可见肝肠纤维化在发展，表明对其治疗需从抗病原和抗纤维化两方面进行;检测虫卵AKP和钙化二者标志物同样具有判别Sj虫卵死与活的意义;PDI和ATPase表达水平，具有随血吸虫感染期延长而增加，随治疗后时间延长而减低的趋势，初步表明此二者分子不仅参与了血吸虫感染所致病理过程，而且还可能具有评估血吸虫病预后或转归的意义。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 药物与试剂

2．2 主要仪器设备

2．3 实验动物与模型建立

2．4 实验方法

2．4．1 试剂配制

2．4．2 标本处理

2．4．3 组织切片HE染色

2．4．4 Masson染色

2．4．5 组织切片中血吸虫卵AKP染色法

2．4．6 组织切片中血吸虫卵钙化物检测(VON KOSSA染色法)

2．4．7 组织中PDI与ATPase表达水平的检测(M．O．M kit免疫组化法)

2．4．8 统计学分析

第三章 结果

3．1 HE染色结果

3．2 MASSON染色结果

3．3 AKP染色结果

3．3．1 两种方法对不同处理方法获得的游离虫卵的染色结果

3．3．2 肝脏与肠黏膜切片AKP染色条件探索

3．3．3 正常组、感染组与治疗组组织切片AKP染色结果

3．3．4 患者活检肠黏膜标本检测结果

3．4 VON KOSSA染色结果

3．5 PDI染色结果

3．6 ATPase染色结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述

致谢

在读硕士期间的研究成果及发表的学术论文