荧光性萘酰亚胺—肽和电活性二茂铁—肽的合成、表征及与Aβ42的相互作用

摘要

β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)纤维化而产生的脑细胞外斑块样聚集物被认为是引起阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)的重要原因之一，但近年来更多研究却表明Aβ的神经毒性主要是由其二聚体、三聚体等寡聚体引起的，由单分子Aβ聚集形成的成熟纤维反而对神经细胞有保护作用。针对这种争论，本研究设计并合成了能对Aβ聚集产生相反作用效果的两种多肽衍生物Naph-Lys-Gly-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Gly-Lys-COOH和Fc-Lys-Gly-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Gly-Lys-COOH，前者能明显加速加剧Aβ聚集，后者却有效抑制了Aβ的纤维化。(Naph:1，8-naphthalimide，1，8-萘酰亚胺;Fc:ferrocenoyl，二茂铁;Ac:acetyl，乙酰基)。
　　 采用固相合成法，以1，8-萘二甲酸酐、二茂铁甲酸和各种氨基酸为原料，苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯（HBTU）及1-羟基苯并三唑(HOBt)为缩合剂，合成了荧光性的Naph-KGKLVFFGK、电化学活性的Fc-KGKLVFFGK和对照肽Fc-KGKLVFFGK，并用IR，NMR和MS进行了表征。用高效液相色谱(HPLC)对三种目标化合物进行了分离纯化，三种多肽化合物的保留时间分别为10.5、12.8、12.8min，纯度均达到了99.5％。光谱研究表明Naph-KGKLVFFGK的最大吸收波长和发射波长分别为344nm和400nm;循环伏安扫描结果表明Fc-KGKLVFFGK在0.2～0.7V范围内出现了一对可逆性较好的氧化还原峰，氧化峰和还原峰电位分别为534mV和443mV，峰电位之差△Ep=91mV，峰电流密度之比Ipa/Ipc=1.14。
　　 采用原子力显微镜(AFM)、硫代黄色素(ThT)荧光光谱、动态光散射(DLS)、电化学等方法研究了合成的三种多肽与Aβ42在近生理条件下的相互作用。结果表明Naph-KGKLVFFGK明显加速和加剧Aβ42的聚集，而Fc-KGKLVFFGK和Ac-KGKLVFFGK能抑制Aβ42的聚集，而前者抑制效果更加明显。产生这种作用效果的原因是三者均含有同源性的KLVFF序列，能起到识别Aβ42作用，而萘酰亚胺修饰基团可以通过芳香环堆积和输水作用力与Aβ结合而促进Aβ的聚集;二茂铁修饰基团具有亲脂性和疏水性能插入到β片层之间，其空间位阻作用能阻止β片层的叠加而有效的阻止Aβ42的聚集。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 阿尔茨海默病和β-amyloid peptide

1．1．1 Alzheimer’s disease可能病因

1．1．2 β-淀粉样蛋白的研究

1．1．3 针对Aβ治疗方法

1．1．4 多肽抑制剂

1．2 多肽

1．2．1 多肽在医药研究中的应用

1．2．2 多肽合成方法

1．2．3 固相合成原理

1．2．4 固相合成流程

1．2．5 固相合成的研究发展前景

1．3 二茂铁

1．3．1 二茂铁的结构和性质

1．1．2 二茂铁在医药研究中的应用

1．1．3 二茂铁生物传感中的应用

1．4 多肽与Aβ相互作用的研究方法

1．4．1 原子力显微镜(AFM)

1．4．2 荧光光谱法

1．4．3 电化学分析方法

1．4．4 其他方法

1．5 选题思路

第二章 Naph-KGKLVFFGK和Fc-KGKLVFFGK的合成和表征

2．1 引言

2．2 主要试剂及仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 化合物的分离方法

2．3．2 化合物的表征方法

2．4 目标化合物的合成

2．4．1 Naph-KGKLVFFGK的合成

2．4．2 Fc-KGKLVFFGK的合成

2．4．3 Ac-KGKLVFFGK的合成

2．5 结果与讨论

2．5．1 Fmoc-Lys(Boc)-COOH与Wang resin的缩合率的测定

2．5．2 目标化合物的纯度检测

2．5．3 目标化合物的表征

2．5．4 多肽的裂解和分离讨论

2．6 小结

第三章 Naph-KGKLVFFGK和Fc-KGKLVFFGK与A-beta的相互作用

3．1 引言

3．2 主要试剂及仪器设备

3．3 实验部分

3．3．1 样品的配置

3．3．2 ThT荧光光谱测定

3．3．3 原子力显微镜(AFM)测试

3．3．4 样品粒径测定

3．4 目标化合物对Aβ42聚集的抑制作用的研究

3．4．1 ThT研究(8)、(12)和(14)对Aβ42聚集的改变作用

3．4．2 Aβ42聚集对(8)的荧光影响

3．4．3 AFM研究Aβ42的聚集

3．4．4 (8)和(12)对Aβ42聚集体粒径变化影响的研究

3．4．5 电化学研究Fc-KGKLVFFGK(12)与Aβ42的相互作用

3．5 小结

第四章 总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间主要的研究成果