我国黑龙江林区鼠型动物巴尔通体感染调查与分离鉴定

摘要

目的:通过本研究了解我国东北林区鼠型动物的巴尔通体的感染情况，从黑龙江林区鼠型动物中分离培养巴尔通体，了解我国我国巴尔通体的遗传进化特征。
　　 方法:
　　 以军事医学科学院流行病室在黑龙江同江、绥芬河、东宁、牡丹江四个地区设置的蜱传疾病研究监测点作为本次研究野鼠捕获点。按照横断面现况调查研究的样本含量估算方法确定样本含量。
　　 用夹夜法捕鼠，鉴定鼠种后，无菌取脾脏组织。按照试剂盒操作步骤提取脾脏组织DNA。采用巴尔通体特异性引物扩增gltA基因，gltA基因检测阳性作为标本阳性的判断标准。对阳性标本进一步扩增16S
　　 56666/23SrRNAITS基因片段，并送测序，进行同源比较和Neighbor-Joining(NJ)建树分析。将阳性标本的脾脏组织接种于巧克力琼脂平板上培养，对疑似菌落首先再次检测gltA基因，随后针对gltA基因阳性的分离株做:①进一步扩增16S/23SrRNAITS基因、16SrRNA基因、FtsZ基因来验证。②做形态学方面的鉴定，包括革兰氏染色、吉姆萨染色、光学显微镜、电子显微镜。③采用持续传代培养保存和冷冻保存。④送测序，与脾脏组织的测序结果比较。
　　 数据处理采用率进行统计描述，率的组间比较用x2检验、Fisher's确切概率法，阳性率影响因素的分析用逐步Logistic回归分析方法。运用SPSS16.0软件完成。
　　 结果:
　　 1.巴尔通体感染情况检测
　　 本研究在2009～2011年中，每年的4～7月从黑龙江林区4个调查点共捕获野鼠514只，共11个种类。共71只检出巴尔通体DNA，阳性率为13.81％（95％CI:11.09％-17.06％），感染的鼠有仓鼠、大仓鼠、大林姬鼠、褐家鼠、黑线姬鼠、红背鼠平、鼩鼱、棕背鼠平、东方田鼠、黑线仓鼠10种，各鼠种间巴尔通体阳性率差异无统计学意义(P=0.098）;不同地区鼠中巴尔通体阳性率差异有统计学意义(P=0.003)，其中牡丹江地区的阳性率最高(18.15％)。
　　 2.巴尔通体的分离鉴定
　　 通过接种巧克力琼脂平板和哥伦比亚血琼脂平板，成功分离6份巴尔通体，3株来源于黑线姬鼠，其它3株分别来源于棕背鼠平、仓鼠、褐家鼠。通过PCR扩增、吉姆萨姬染色、电子显微镜观察及特异序列分析等多种方法鉴定，证实巴尔通体分离成功。
　　 3.序列遗传进化分析
　　 阳性标本扩增gltA，16S rRNA间隔区基因片断并进行基因序列测定及比对分析，东北黑龙江林区鼠型动物感染的巴尔通体核苷酸序存在很大差异。
　　 结论:本研究首次在黑龙江地区鼠中检测巴尔通体感染情况，该地区鼠中存在巴尔通体自然感染，同时成功分离出6株巴尔通体，序列分析显示巴尔通体基因型别的多样性，推动了黑龙江地区的巴尔通体病的监测、科研，同时也为我国北方地区巴尔通体的研究奠定一定的基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 调查点选取

1．1．2 标本采集和样本含量

1．1．3 主要试剂

1．1．4 主要仪器

1．2 研究方法

1．2．1 DNA提取，模板制备

1．2．2 聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)

1．2．3 分离鉴定

1．2．4 序列分析

1．2．5 统计学分析

1．3 质量控制

1．3．1 标本采集

1．3．2 实验过程

第二章 结果与分析

2．1 鼠型动物感染情况

2．1．1 捕获动物基本情况

2．1．2 鼠型动物性别、生境对阳性率的影响

2．1．3 阳性率结果的多因素分析

2．2 分离鉴定结果

2．2．1 鼠脾脏组织接种、培养结果

2．2．2 PCR检测结果

2．2．3 革兰氏染色

2．2．4 吉姆萨染色

2．2．5 电镜观察

2．2．6 脾脏组织和菌体的基因检测结果比较

2．2．6 传代和保存

2．3 巴尔通体的遗传特征分析

2．3．1 基于gltA基因的遗传进化分析

2．3．2 基于16S／23SrRNAITS(F311-R452)基因的遗传进化分析

2．3．3 基于16S／23SrRNAITS(F455-R885)基因的遗传进化分析

第三章 讨论

3．1 我国巴尔通体病的研究现状

3．2 鼠型动物的自然感染

3．2．1 本研究的特异性引物

3．2．2 鼠型动物巴尔通体感染情况

3．3 分离鉴定

3．3．1 巴尔通体的分离培养

3．3．2 脾脏组织和菌体的基因检测结果比较

3．3．3 形态学分析

3．4 遗传特征分析

第四章 结论

参考文献

附件

综述

致谢

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