我国黑龙江林区蜱中巴贝西虫感染调查与分离鉴定

摘要

目的：通过本研究了解我国黑龙江林区蜱中巴贝西虫的感染情况及遗传多样性特征，从黑龙江林区蜱中分离培养到巴贝西虫，并进行鉴定。
　　方法：本研究选取我国黑龙江省牡丹江市大石沟林场和黑牛背林场为调查点,2010年～2012年连续三年在蜱活动高峰期4～8月用布旗法在调查点采集游离蜱，分类鉴定后提取DNA，采用聚合酶链反应方法用PRIO-A/PRIO-B引物扩增蜱中巴贝西虫18S rRNA基因，将阳性样本送测序，并进行同源性比较和系统进化分析，以分析我国黑龙江林区蜱中巴贝西虫的感染情况以及该地区蜱中巴贝西虫的基因型。采用2011年5-7月在上述地区采集到的游离全沟硬蜱叮咬SCID小鼠，定期对叮咬后的SCID小鼠用PRIO-A/PRIO-B引物进行PCR检测以及形态学鉴定，对检测阳性SCID小鼠进行定期观察及传代培养。基因序列方面鉴定:用PRIO-A/PRIO-B引物扩增巴贝西虫18SrRNA基因，进行同源比较和Neighbor-Joining(NJ)建树分析。形态学方面的鉴定:包括吉姆萨染色后光学显微镜观察和电子显微镜观察。保存:采用持续传代培养和液氮冷冻保存。数据处理运用SPSS16.0软件完成，采用到的统计检验方法有x2检验和Fisher's确切概率法。
　　结果：2010～2012年在蜱流行季节期间采集到2841只蜱，包括全沟硬蜱（2380只）和嗜群血蜱(461只)，进行检测发现巴贝西虫阳性共有36只，感染为1.27％。嗜群血蜱和全沟硬蜱中巴贝西虫的感染率分别为2.82％(13/461)和0.97％(23/2380)，有统计学差异。大石沟林场和黑牛背林场间蜱种构成存在统计学差异。对蜱种构成作为混杂因素进行调整后，两林场间蜱中巴贝西虫感染率无统计学差异。2010年蜱中巴贝西虫感染率为1.08％;2011年蜱中巴贝西虫感染率为1.60％;2012年蜱中巴贝西虫感染率为1.01％，三年间蜱中巴贝西虫的感染率无统计学差异。在2010年，不同月份间巴贝西虫感染率有统计学差异。不同环境因素间蜱中巴贝西虫感染率无统计学差异。序列分析显示我国黑龙江林区蜱中巴贝西虫存在基因多样性，包括Babesia sp.EU1、B.microti、B.bigemina、B.divergens、Babesia sp.hlj242-1ike和Babesia sp.hlj874。通过蜱叮咬SCID小鼠实验成功分离到B.divergens，用PCR扩增、吉姆萨姬染色后光学显微镜观察及电子显微镜观察方法进行鉴定，证实B.divergens分离成功。
　　结论：通过本次研究获得了我国黑龙江林区蜱中巴贝西虫的感染情况，序列分析显示该地区蜱中巴贝西虫基因型存在多样性。成功从蜱中分离到B.divergens，为我国巴贝西虫病的深入研究奠定了基础(。)

目录

声明

摘要

缩略词表

1 绪论

2 我国黑龙江林区蜱中巴贝西虫自然感染情况的调查研究

2．1 材料与方法

2．1．1 调查点选取

2．1．2 蜱标本采集

2．1．3 蜱标本处理及总DNA提取

2．1．4 聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)

2．1．5 测序及序列分析

2．1．6 统计学分析

2．1．7 主要仪器以及试剂

2．2 结果与分析

2．2．1 蜱种类的鉴定

2．2．2 蜱中巴贝西虫感染情况

2．2．3 序列分析

2．3 讨论

3 蜱中巴贝西虫分离与鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 实验动物的选取

3．1．2 蜱叮咬实验动物方法

3．1．3 叮咬蟀总DNA提取及PCR检测

3．1．4 实验动物的饲养以及观察指标

3．1．5 阳性实验动物的持续观察以及传代保种

3．1．6 阳性实验动物标本的保存

3．2 结果与分析

3．2．1 叮咬蜱检测情况

3．2．2 SCID小鼠体内培养结果

3．2．3 保存

3．3 讨论

4 结论

参考文献

附件

附表1 采集点环境调查表

附件2 本研究注册序列

综述 巴贝西虫病研究进展

攻读学位期间主要的研究成果目录

致谢