远端缺血后处理在大鼠全脑缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制研究

摘要

在各种疾病(脑卒中、微血栓、脑血管痉挛和硬化、脑血液动力学改变、颈部动脉疾病或椎动脉受压等)或手术(严重颅脑外伤手术、控制性降压、颅内动脉瘤夹闭术、冠状动脉旁路移植术以及颈动脉血管移植术等)中会出现全部或局部的脑组织的短暂缺血,引起脑组织血液灌注不足,疾病经过积极治疗后或手术结束后会恢复脑组织的血液供应,但缺血后的血流供应恢复在某些情况下可导致脑组织损伤和功能障碍的加重,这种恢复血流灌注后的脑组织损伤和功能障碍加重现象称为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIR)。为了减轻脑缺血造成的损伤,降低脑缺血的死亡率,如何有效的防治缺血缺氧性脑损伤已经成为当今神经学领域的一个研究热点。近年来针对脑缺血再灌注损伤的保护研究越来越多,研究背景大量研究试图寻找可减轻或预防脑缺血再灌注损伤的方法或药物,并且己经在动物模型上获得一定成功,但是这些方法和药物很少能成功用于临床。
　　缺血再灌注损伤后短暂的亚致死性缺血或其它亚致死性应激可对随后的损伤性缺血提供保护作用,此现象被称为缺血后处理。最先在心脏发现缺血后处理的保护作用,随后许多学者研究证实了在脑、脊髓、骨骼肌、肝脏、肾脏、肺脏和小肠等器官组织也存在缺血后处理现象。最近,有研究发现,一个器官的短暂缺血可诱导另一器官的缺血耐受,此现象被学者们称为远端缺血后处理。目前许多关于远端缺血后处理的研究是针对心脏和肾脏的,远隔后处理是否对脑也能提供保护作用还不清楚。但是神经元与其它细胞在遗传信息方面是相似的,因此我们有理由认为其它器官的适度应激可对脑也能够提供保护作用。为证实这一设想,本研究采用全脑缺血模型,观察远端肢体缺血后处理(limb ischemic postconditioning,LIP)对脑缺血再灌注损伤的影响。
　　本研究选择健康成年SD大鼠作为研究对象,采用四动脉阻断法行全脑缺血再灌注模型,观察远端肢体缺血后处理对大鼠脑缺血/再灌注(I/R)损伤的影响,研究远端肢体缺血后处理对神经的保护作用,从而探讨远端肢体缺血后处理是否有脑保护作用,并且进一步研究PI3K/Akt/eNOS信号通路是否介导这一作用。本实验首先通过Nissl染色评价定大鼠海马CA1区和额叶皮层在脑缺血再灌注后神经元形态学改变,观察其中存活神经元密度,用Morris水迷宫检测空间学习与记忆能力的改变,通过检测远端肢体缺血后处理对脑缺血再灌注后大鼠迟发性神经元死亡和大鼠空间学习及记忆能力的影响,证明远端肢体缺血后处理的神经保护作用。以此为基础,于I/R后24h和48h取海马CA1区组织用Western blot及免疫组化法检测中凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达水平。然后用TUNEL法检测48h海马CA1区及额叶皮层的神经元细胞的凋亡情况,然后,通过48h检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)等指标来检测神经元的氧化应激水平,观察远端肢体缺血后处理对大鼠全脑缺血再灌注损伤的影响。随后,第三部分则于I/R后再灌注48 h时行海马CA1区TUNEL阳性细胞计数,测定I/R后再濯注48h时海马CA1区p-eNOS、eNOS、p-Akt及Akt的蛋白表达水平,再灌注4 d时行Morris水迷宫实验,再灌注7 d时计算海马Cal区神经元密度。观察eNOS及PI3K/Akt通路在远端肢体缺血后处理(RIPoC)减少大鼠全脑缺血在灌注(I/R)损伤中的作用。
　　本实验发现:①远端肢体缺血后处理(RIPoC)对明显减少缺血再灌注所导致的迟发性神经元死亡及锥体神经细胞凋亡发挥着明显的神经保护作用,它可以减少大脑的迟发性神经元死亡,从而可以使大鼠的空间学习和记忆能力的减退得到明显改善,发挥其在全脑I/R损伤中的神经保护作用。②RIPoC在大鼠的全脑缺血再灌注中可以通过改善氧化应激水平,调节凋亡相关蛋白减少大脑的迟发性神经元死亡,说明远端肢体缺血后处理对大鼠再灌注损伤的脑保护作用与氧化应激和脑组织相关蛋白分子相关联,RIPoC在大鼠的全脑缺血再灌注中可以通过改善氧化应激水平及调节脑组织相关蛋白分子发挥其在全脑I/R损伤中的神经保护作用。③预先使用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME和PI3K抑制剂LY294002能够有效地抑制RIPoC脑保护作用,证实在全脑缺血再灌注模型中RIPoC的脑保护作用是与PI3K/Akt/eNOS通路有关。RIPoC是通过激活PI3K/Akt信号通路,促进Akt的激活,进而减少全脑缺血再灌注损伤的。使用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME能够减少RIPoC后的eNOS及p-eNOS的表达,并有效地抑制RIPoC的脑保护作用。同时,使用PI3K抑制剂LY294002能够明显减少RIPoC后eNOS及p-eNOS的表达。说明RIPoC通过激活PI3K/Akt信号通路,促进eNOS的激活,从向发挥脑神经保护作用。PI3K/Akt/eNOS信号通路在RIPoC的脑神经保护过程中起着重要的作用。
　　本课题的实验内容分为三部分:
　　1远端肢体缺血后处理对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用。
　　2远端肢体缺血后处理对大鼠全脑缺血再灌注损伤中脑组织相关蛋白分子的影响。
　　3 PI3K/Akt/eNOS通路在远端肢体缺血后处理减少全脑缺血再灌注损伤中的作用。
　　第一部分肢体远端缺血后处理对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用
　　[摘要]目的:研究远端肢体缺血后处理(RIPoC)在大鼠的全脑缺血再灌注(I/R)模型中的神经保护作用及其机制。方法:用四动脉阻断法(4-VO)制作全脑I/R模型。选择雄性SD大鼠(200-250g)。随机分为四组:sham组,I/R组,I/R+RIPoC组,RIPoC组。于I/R后7d取大鼠海马CA1区和额叶皮层组织行Nissl染色,观察中存活神经元密度,于I/R后4d开始用Morris水迷宫检测大鼠空间学习与记忆能力的改变。结果:同I/R组相比,I/R+RIPoC组中海马CA1区及额叶皮层中I/R后迟发性神经元死亡明显减少(P＜0.01),空间学习和记忆能力的减退明显改善(P＜0.05)。结论:RIPoC在大鼠的全脑I/R中可以减少大脑的迟发性神经元死亡,从而改善空间学习与记忆能力,发挥其在全脑I/R损伤中的神经保护作用。
　　第二部分肢体远端缺血后处理对大鼠全脑缺血再灌注损伤中脑组织相关蛋白分子的影响
　　[摘要]目的:探讨远端肢体缺血后处理对大鼠再灌注损伤的脑保护作用与氧化应激的关联,与凋亡相关蛋白的表达水平的关联。方法:用四动脉阻断法(4-VO)制作全脑I/R模型。选择雄性SD大鼠(200-250g)。随机分为四组:sham组,I/R组,I/R+RIPoC组,RIPoC组。电凝双侧椎动脉后夹闭双侧颈总动脉至8min后松开,再灌注开始立即夹闭双侧股动脉实行15min缺血/15min再灌注,共计3个循环;于I/R后24h和48h用TUNEL法检测海马Cal区和额叶皮层的神经元凋亡,于I/R后48h检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)。于I/R后24h和48h取海马CA1区组织用Westernblot及免疫组化法检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达水平。结果:同I/R组相比,,I/R+RIPoC组中海马CA1区及额叶皮层中I/R后迟发性神经元死亡及TUNEL阳性细胞数量明显减少(P＜0.01),海马Cal区中Bcl-2明显上调,Bax明显下调(P＜0.01),SOD和CAT的活性明显增加,MDA水平明显降低(P＜0.01)。结论:RIPoC在大鼠的全脑缺血再灌注中可以通过改善氧化应激水平,调节凋亡相关蛋白减少大脑的迟发性神经元死亡,发挥其在全脑I/R损伤中的神经保护作用。
　　第三部分 PI3K/Akt/eNOS通路在远端缺血后处理减少全脑缺血再灌注损伤中的作用
　　[摘要]目的探讨eNOS及PI3K/Akt通路在远端肢体缺血后处理(RIPoC)减少大鼠全脑缺血在灌注(I/R)损伤中作用。方法成年雄性SD大鼠100只,体重为200～250 g,随机分为5组(n=20):假手术组(S组)、I/R组、I/R+RIPoC组、L-NAME+I/R+RIPoC组及LY294002+I/R+RIPoC组。采用四动脉阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注模型。S组不制备全脑缺血再灌注模型;I/R+RIPoC组、L-NAME+I/R+RIPoC组及LY+I/R+RIPoC组于再灌注开始行双侧股动脉缺血15 min,再灌注15 min,共计3个循环。L-NAME+I/R+RIPoC组于缺血前10min腹腔注射非选择性一氧化氮合酶(NOS)抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME),LY+I/R+RIPoC组于缺血前10min侧脑室注射磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002。再灌注48 h时行海马CA1区TUNEL阳性细胞计数,测定海马CA1区p-eNOS、eNOS、p-Akt及Akt的蛋白表达水平,再灌注4 d时行Morris水迷宫实验,再灌注7 d时计算海马CA1区神经元密度。结果与S组比较,I/R组、I/R+RIPoC组、L-NAME+I/R+RIPoC组及LY+I/R+RIPoC组再灌注时海马CA1区凋亡细胞增加,神经元密度降低,行为学损伤增加。与I/R组比较,I/R+RIPoC组再灌注时凋亡细胞减少,神经元密度增加,行为学损伤明显减少。与I/R+RIPoC组比较,L-NAME+I/R+RIPoC组及LY+I/R+RIPoC组再灌注时凋亡细胞增加,神经元密度降低,行为学损伤明显增加。L-NAME能够抑制RIPoC后p-eNOS和eNOS的升高,LY294002不仅能抑制RIPoC后p-Akt的升高,而且能抑制RIPoC后p-eNOS和eNOS的升高。结论RIPoC能够减轻大鼠全脑I/R损伤,其作用机制与PI3K/Akt途径介导的eNOS激活和上调有关。