5-AzA-dc逆转非小细胞肺癌细胞顺铂耐药相关microRNA的筛选鉴定

摘要

研究背景:
　　顺铂是非小细胞肺癌(NSCLC)最主要的化疗药物，但易产生耐药性，如何改变NSCLC耐药性及耐药逆转机制研究是当前的热点之一。我们前期研究表明，5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dc)可逆转NSCLC细胞的顺铂耐药性，但具体机制不明。最近研究显示，microRNA(miRNA)与肿瘤顺铂耐药相关，而5-Aza-dc可影响肿瘤细胞的miRNA表达谱。因而我们推测:miRNA可能在5-Aza-dc诱导的NSCLC细胞顺铂耐药逆转中发挥重要调控作用。本实验通过检测5-Aza-dc诱导前后的耐顺铂细胞株A549/DDP细胞中miRNA表达谱变化，及预测分析miRNA的靶基因，探讨miRNA是否与5-Aza-dc诱导的NSCLC细胞顺铂耐药逆转相关，为深入研究5-Aza-dc逆转顺铂耐药的miRNA调控机制提供基础。
　　研究目的:
　　探讨miRNA是否与5-Aza-dc诱导的NSCLC细胞顺铂耐药逆转相关;初步筛选出调控5-Aza-dc逆转NSCLC细胞顺铂耐药过程的相关miRNA及靶基因。
　　研究方法:
　　以MTT法检测A549/DDP细胞对顺铂的耐药指数及5-Aza-dc对A549/DDP细胞的耐药逆转作用。miRNA芯片技术检测5-Aza-dc诱导A549/DDP细胞后miRNA表达谱差异;quantitative real-timePCR(RT-qPCR)验证芯片结果。生物信息学方法预测miRNA的靶基因，并对靶基因进行GO分析及KEGG信号通路分析。
　　结果:
　　1.A549细胞和A549/DDP细胞对顺铂的IC50分别为6.79±1.58μM，39.39±2.86μM，耐药指数RI为5.80，该A549/DDP细胞鉴定为对顺铂耐药的肺癌细胞株。无毒剂量20μM5-Aza-dc诱导后的A549/DDP细胞对顺铂的IC50下降为17.21±3.13μM，耐药逆转指数为2.29，20μM5-Aza-dc诱导对A549/DDP细胞有明显的耐药逆转作用。
　　2.总RNA质检显示样本纯度高，完整性好，符合miRNA芯片要求。miRNA芯片结果显示经5-Aza-dc诱导细胞后有131条差异表达的miRNA，其中43条miRNA(27条上调，16条下调)表达差异倍数在2倍以上，两个样品芯片杂交信号值均在100以上。RT-qPCR结果显示与miRNA芯片结果趋势相似。
　　3.生物信息学预测了miRNA如miR-320a，let-7b，miR-548j的靶基因，并分析靶基因的生物学功能及相关信号通路，从中初步筛选出可能介导5-Aza-dc逆转NSCLC细胞顺铂耐药的相关靶基因，如BCL2L1，SMAD2，E2F3等，并分析得到靶基因相关的MAPK信号通路，Wnt信号通路，JAK/STAT信号通路，PPAR信号通路，凋亡相关通路，药物代谢等信号通路，提示miRNA可能通过影响这些通路活性参与调控5-Aza-dc诱导的NSCLC细胞顺铂耐药逆转。
　　结论:
　　miRNA可能与5-Aza-dc诱导的NSCLC细胞顺铂耐药逆转相关，其机制可能是通过影响靶基因如BCL2L1，SMAD2，E2F3等的表达，进而调控NSCLC细胞的顺铂耐药逆转过程。

目录

声明

摘要

缩略词简表

前言

第一章 材料与方法

1．1 主要材料和仪器

1．2 实验方法

1．3 统计学处理

第二章 结果

2．1 A549／DDP细胞的耐药性验证

2．2 验证5-Aza-dc对A549／DDP细胞顺铂耐药的逆转作用

2．3 筛选5-Aza-dc诱导A549／DDP细胞后差异表达的miRNA

2．4 荧光定量RT-qPCR验证miRNA芯片结果

2．5 逆转A549／DDP顺铂耐药相关miRNA的生物信息学分析

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

综述 microRNA在肺癌中的研究进展

攻读学位期间主要的研究成果

致谢