人胚胎干细胞向胰岛素阳性细胞诱导分化体系的优化

摘要

第一章、人胚胎干细胞(hESCs)向胰腺内分泌前体细胞诱导分化的比较
　　目的:通过比较文献中已报道的效率较高的诱导方案，找到在本实验室条件下获得胰腺内分泌前体细胞的最佳诱导方案。
　　方法:体外诱导hESCs需要依次经历限定性内胚层、胰腺内分泌前体最终才会成为胰岛素阳性细胞，这是体内β细胞发育分化过程的重演。利用本实验室已经建立好的条件，将人胚胎干细胞诱导至限定性内胚层阶段。然后分三组分别用D'Amour、Hongkui Deng、 Hosoya实验室报道的诱导方案将细胞往胰腺内分泌前体诱导。在诱导的第10天以及第13天收集样本，用免疫荧光、间标流式、real-time PCR等检测手段比较三种诱导方案获得胰腺内分泌前体细胞的效率。
　　结果:仅Hosoya小分子方案组在第10天至第13天的过程中PDX1+细胞的比例出现明显的上调;D'Amour组呈现显著下降趋势;Hongkui Deng组呈现基本持平状态。仅Hosoya小分子方案组在第10天至第13天能持续检测到较多的NGN3+细胞;D'Amour组呈现下降趋势，且NGN3+细胞比例很低;Hongkui Deng组几乎检测不到NGN3+细胞。
　　结论:仅Hosoya小分子方案能更好的将限定性内胚层细胞诱导为胰腺内分泌前体细胞(PDX1+&NGN3+)。
　　第二章、人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性(Ins+)细胞诱导分化的研究
　　目的:比较基础培养基:D/F-12、高糖-DMEM;成熟因子方案与Hosoya的小分子方案获得胰岛素阳性细胞的效率。
　　方法:利用第一章所得到的优势方案（小分子诱导方案），将hESCs诱导至胰腺内分泌前体起始阶段，即诱导的第10天。然后将细胞分为两大组，其中一组用成熟因子方案诱导，另一组继续用 Hosoya实验室报道的小分子方案诱导;分别考察两种诱导方案下，基础培养基中不同葡萄糖浓度在诱导第18天获得Ins+细胞的差异。用免疫荧光、间标流式、real-time PCR等检测手段比较各方案获得Ins+细胞的效率。
　　结果:高糖-DMEM加成熟因子组在诱导的第18天获得Ins+细胞的效率最高，达27.43％±2.97％。D/F-12加成熟因子组、高糖-DMEM加小分子组和D/F-12加小分子组的Ins+细胞比例都不及21％。而追溯到诱导的第13天检测成熟因子和小分子组在表达胰腺内分泌前体阶段标记基因显示成熟因子组PDX1、NGN3、Beta2基因的mRNA的相对表达量是小分子组的数倍结论:培养基中葡萄糖浓度对终末形成Ins+细胞效率在成熟因子组中高糖能促使β细胞增殖，低糖能使细胞内Ins含量增加;而在小分子组中无区别。在获得Ins+细胞效率上高糖-DMEM加成熟因子比小分子方案有优势，其原因可能并不是胰腺内分泌前体阶段，PDX1+&NGN3+细胞数量的多少，而与其PDX1和NGN3表达量有关。推测PDX1、NGN3的表达可能存在一个阈值是激活其下游基因启动所必须的。
　　第三章、人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导方案的优化
　　目的:以高糖-DMEM加成熟因子诱导方案为基础优化人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导方案。
　　方法:利用第一章所得到的优势方案（小分子诱导方案），将hESCs诱导至胰腺内分泌前体起始阶段，即诱导的第10天。以第二章中高糖-DMEM加成熟因子诱导方案为基础进行分组，将成熟因子Betacellulin、Exendin-4、IGF-1进行自由组合，分为无因子组、单因子组、双因子组、三因子组。将细胞诱导至第18天，用免疫荧光、间标流式、real-time PCR等检测手段比较各方案获得Ins+细胞的效率。
　　结果:在诱导第18天获得Ins+细胞比例最高的三组分别为双因子组中的Exendin-4&IGF-1、单因子组中的Exendin-4及IGF-1，其值分别为:32.63％±8.50％、31.60％±2.16％、30.63％±1.37％。其中单因子组中Exendin-4在real-time PCR检测的各项胰岛终末细胞标记基因的mRNA相对表达量与其余组相比明显要高。免疫荧光也直观的反应出其优势。
　　结论:在高糖-DMEM加成熟因子诱导方案基础上优化后，高糖-DMEM加单因子Exendin-4在D18可获得31.60％±2.16％Ins+细胞，是目前在我们实验室条件下获得的最高诱导效率。

目录

声明

摘要

前言

第一章 人胚胎干细胞(hESCs)向胰腺内分泌前体细胞诱导分化的比较

1．材料与试剂

1．1 细胞

1．2 试剂

1．2 试剂-分子生物学

1．3 主要仪器

2．方法

2．1 人胚胎干细胞培养

2．2 hESCs的诱导分化

2．3 免疫荧光

2．4 间标流式检测

2．5 RNA的抽提和cDNA的合成

2．6 real-time PCR检测

3 结果

3．1 hESCs的诱导分化

3．2 免疫荧光染色结果

3．3 间标流式检测结果

3．4 real-time PCR检测基因表达结果

4 讨论

第二章 人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导分化的研究

1．材料与试剂

1．1 细胞

1．2 试剂

1．3 主要仪器

2．方法

2．1 人胚胎干细胞培养

2．2 hESCs的诱导分化

2．3 免疫荧光

2．4 间标流式检测

2．5 RNA的抽提和cDNA的合成

2．6 real-time PCR检测

2．7 胰岛素阳性细胞中平均胰岛素含量测定

3 结果

3．1 hESCs的诱导分化

3．2 免疫荧光染色结果

3．3 间标流式检测结果

3．4 real-time PCR检测基因表达结果

3．5 胰岛素阳性细胞中平均胰岛素含量测定

4 讨论

第三章 人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导方案的优化

1．材料与试剂

1．1 细胞

1．2 试剂

1．3 主要仪器

2．方法

2．1 人胚胎干细胞培养

2．2 hESCs的诱导分化

2．3 间标流式检测

2．4 RNA的抽提和cDNA的合成

2．5 real-time PCR检测

2．6 免疫荧光

3 结果

3．1 hESCs的诱导分化

3．2 间标流式检测结果

3．3 real-time PCR检测基因表达结果

3．4 免疫荧光染色结果

4 讨论

总结

参考文献

综述 从人胚胎干细胞获得胰岛素阳性细胞的研究进展

致谢

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