Catheps in V作为保护组织损伤/抗炎新型靶点的前期机制

摘要

背景:胞外的双硫键HMGB1(高迁移率族蛋白B1)是一种关键的损伤相关模式分子DAMP，在众多急慢性疾病中，通过细胞表面Toll样受体4(TLR4)介导病理性炎症:HMGB1-TLR4信号通路的特异性抑制剂可以选择性阻断内源性炎症激活的早期事件，为相关炎症性疾病提供新的治疗药物。基于HMGB1-TLR4-TNF-α信号轴的细胞高通量筛选发现，第一代HIV蛋白酶抑制剂Saquinavir(SQV)可有效阻断HMGB1-TLR4激活后的炎症因子（TNF-α和IL-6）释放。我们前期实验发现SQV预处理能显著减轻肝脏热缺血再灌注模型（Liver Ischemia/Reperfusion Injury,IR）的肝损伤，而HMGB1-TLR4信号通路正是Liver IR模型的核心通路之一，同时鉴定到半胱氨酸蛋白酶V(Cathepsin V CTSV)是SQV的哺乳动物靶点之一。而细胞实验与体外重组蛋白实验均证实CTSV与TLR4存在相互作用且可被SQV阻断，CTSV低表达致使HMGB1-TLR4激活受限，揭示CTSV在TLR4信号通路中的未知作用，提示SQV通过靶向CTSV而干预HMGB1-TLR4信号轴及其介导疾病。
　　目的:本研究中，我们拟深入探究CTSV与TLR4相互作用的实质及其在TLR4信号通路中的作用机制，同时全面评估SQV抑制HMGB1-TLR4信号通路和保护动物炎症模型的具体机制，为开发CTSV为新型抗炎靶点和扩大SQV适应症提供实验基础。。
　　方法:以SQV和另一种已知的CTSV抑制剂SID26681509(SID)为靶向CTSV的药物探针，分别评估SQV/SID对TLR4信号通路受体水平的早期事件（配体-受体结合、受体二聚化、TLR4-MyD88和TLR4-TRIF活化）以及下游公共通路即NF-κB水平的影响，以期在TLR4信号通路中定位CTSV。同时分别评估CTSV低表达和SQV/SID抑制CTSV对其它模式识别受体(TLR1/2、TLR3、IL-1R)介导信号通路的影响，与前一部分内容相互佐证。运用点突变结构域变异体的方法探究CTSV与TLR4相互作用所涉及的结构域，决定CTSV蛋白酶活性是否参与TLR4信号通路，明确SQV抑制CTSV的具体机制。同时观察SQV预处理对SQV保护肝脏缺血再灌注模型的必要性，以评估CTSV抑制剂用于临床情况的可行性。
　　结果:我们发现SQV在受体水平特异性抑制TLR4介导的MyD88-IRAK4/1活化和TRIF-IRF3的活化，而在NF-κB水平非特异性地抑制TLR1/2、3、4和IL-1R以及TNFR引起的NF-κB活化或TNF-α释放。SID作为特异性CTSV抑制剂同样具有上述特性。而CTSV低表达可造成MyD88依赖性的TLR1/2、TLR4下游TNF-α生成减少，但对TRIF依赖性的TLR3通路无影响。在相同浓度时SQV抑制TLR4-MyD88-IRAK1激活的程度强于SID，与两者在阻断CTSV-TLR4相互作用的强弱趋势一致，与两者在抑制CTSV蛋白酶活性的强弱趋势相反。同时，酶活性减低的CTSV变异体（酶结构域变异体C138S，N端糖基化变异体N292Q）依旧可与TLR4相互作用。此外，仅在灌注期给予SQV依旧可以保护HMGB1-TLR4介导的肝脏缺血再灌注损伤。
　　结论:本研究进一步确定Cathepsin V是FDA认证药物HIV蛋白酶抑制剂SQV特异性拮抗HMGB1-TLR4介导炎症的新型靶点，并揭示CTSV参与TLR4受体水平对MyD88的募集，而SQV的作用方式很可能是直接阻断CTSV与TLR4的相互作用。同时发现了SQV和SID可分别从TLR4受体水平和NF-κB水平抑制HMGB1-TLR4炎症通路活化，且即使不预处理，SQV依旧对炎症疾病模型具有保护作用，揭示了以CTSV作为抗炎靶点的临床应用可行性。故在后续研究中我们可运用FDA认证药物且药理毒性明确的SQV作为先导药物，开发CTSV成为保护组织损伤/抗炎的新型靶点，具有很好的转化前景。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第二章 Saquinavir(SQV)对TLR4信号通路早期事件的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 主要试剂

2．1．2 BIAcore蛋白质相互作用分析

2．1．3 细胞培养与质粒

2．1．4 HEK293-MD2／CD14稳定转染细胞系的构建

2．1．5 PMA诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞

2．1．6 Saquinavir／沙奎那韦的配制

2．1．7 免疫共沉淀与免疫印迹

2．2 结果

2．2．1 SQV不阻断HMGB1与MD2的结合

2．2．2 SQV阻断LPS引起的TLR4受体同源二聚化

2．2．3 SQV阻断TLR4募集接头蛋白MyD88

2．2．4 SQV对LPS诱导的TLR4—TRIF通路的影响

第三章 SQV对TLR4介导信号通路的选择性评估

3．1 材料与方法(仅列出与之前不重复的材料、方法)

3．1．1 主要试剂及来源

3．1．2 细胞刺激与免疫印迹

3．1．3 酶联免疫吸附试验(ELISA)

3．1．4 HEK293-NF-κB SEAP／CD14／MD2／TLR4-HA／GFP稳定转染细胞系构建

3．1．5 HEK-BlueTM Detection实时检测SEAP水平

3．2 结果

3．2．1 SQV在受体水平特异性抑制TLR4诱导的MyD88通路活化

3．2．2 SQV在NF-κB水平非特异性抑制多种PRR引起的TNF-α释放

3．2．3 SQV抑制TNF-α引起的NF-κB活化

第四章 Cathepsin V在TLR4信号通路中的作用机制

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试剂与来源

4．1．2 细胞刺激、免疫共沉淀与免疫印迹

4．1．3 CTSV siRNA瞬时转染THP-1单核巨噬细胞

4．1．4 CTSV与CTSV活性变异体质粒构建与转染

4．1．5 TNF-α和IL-6 ELISA检测

4．1．6 SID26681509(SID)和ST033438(STO)的配制

4．1．7 LDH细胞毒性分析

4．1．8 CTSV活性分析

4．2 结果

4．2．1 CTSV与TLR4-MyD88复合体存在相互作用

4．2．2 CTSV表达受限可减弱TLR1／2、TLR4、IL-1R的激活但不影响TLR3

4．2．3 CTSV与TLR4之间的相互作用不需要CTSV的蛋白酶活性

4．2．4 CTSV抑制剂SID26681509抑制TLR4下游MyD88和TRIF活化

4．2．5 SID非特异性抑制TLR1／2，3，4和TNFR介导的TNF-α释放或NF-κB活化

4．2．6 SQV、SID、STO334可阻断CTSV-TLR4相互作用且SQV效果最强

第五章 SQV对肝脏缺血再灌注损伤的保护不需要药物预处理

5．1 材料与方法

5．1．1 肝脏热缺血再灌注损伤(Liver IR)模型建立

5．1．2 SQV预处理对Liver IR保护作用的必要性评估实验分组

5．1．3 SQV供在体实验使用的配制方法

5．2 结果

第六章 讨论

第七章 结论

文献综述

参考文献

附录

致谢

攻读八年制博士学位期间的研究成果