全外显子测序发现遗传性心脏传导疾病致病基因SCN5A新突变

摘要

背景:全外显子测序是近年来逐步兴起的一种第二代测序技术。通过外显子捕获芯片以及边合成边测序技术，全外显子测序可在极短时间内获得海量的测序信息。与传统的Sanger测序法相比，它具有高效便捷的特点，可以以相对低廉的成本同时完成上万个基因的测序。自2009年美国学者Ng等首次运用全外显子测序分析单基因孟德尔遗传病以来，目前通过此方法已有数十个遗传病的致病基因被发现。运用全外显子测序对遗传性心脏病的研究多集中于心肌病，相继发现了致心律失常性右室心肌病致病基因DES、肥厚型心肌病致病基因MRPL44、MTO1、AGK、MRPL3、AARS2以及扩张性心肌病致病基因BAG3、GATAD1，而有关心律失常的报道相对较少。本课题通过全外显子测序研究了一个遗传性心脏传导疾病家系，旨在找出致病基因，为疾病发病机制的研究提供参考资料，同时也为将来产前诊断、遗传咨询以及基因诊断提供帮助。
　　目的:探查一个遗传性心脏传导疾病家系的致病基因。
　　方法:首先通过心电图与询问病史对一个包含5代37人的大家系进行心脏传导疾病的筛查，并采集外周血样以提取gDNA;接着选取其中的三名患者与一名正常人进行全外显子测序，并利用dbSNP数据库、TGP数据库、YH数据库以及ESP数据库对测序结果中的已知变异进行筛查;再在去除已知变异后的结果中选出三名患者共有而正常人没有的疑似突变;然后运用Mutation Taster、SIFT以及Poly Phen-2对疑似突变进行预测，选出致病性较高的候选突变;最后利用PCR扩增以及Sanger测序法将候选突变在家系内与家系外进行验证，并在HGMD数据库、Pubmed数据库以及Google scholar上进行查重。
　　结果:该家系遗传性心脏传导疾病呈现常染色体显性遗传特点，家系中存在10名患者。经过全外显子测序、公共数据库筛查、疑似变异分析以及功能软件预测后，留下12个候选突变。经过家系内与家系外验证发现仅有SCN5A上的杂合变异c.4485 C＞A(p.Y1495X)与心脏传导疾病发生共分离。该变异未被报道过，是一个新发现的突变。
　　结论:1.本研究报道了一个包含10名患者的罕见心脏传导疾病大家系。2.研究家系的致病突变为SCN5A上新发现的杂合突变p.Y1495X。3.全外显子测序可以快速鉴定遗传性心脏传导疾病的致病基因。

目录

声明

摘要

缩略词及物理单位说明表

1 引言

1．1 心脏传导系统的组成与功能

1．2 CCD相关基因

1．3 WES的应用

2 实验材料与方法

2．1 家系基本资料

2．2 心电图筛查

2．3 血样采集

2．4 外周血gDNA提取

2．5 gDNA浓度及纯度测定

2．6 全外显子测序

2．7 已知变异查询比对

2．8 “overlap”法筛选候选突变

2．9 突变功能预测

2．10 候选基因突变点引物设计与处理

2．11 PCR扩增

2．12 凝胶电泳

2．13 DNASanger法测序

2．14 突变查重

3 实验结果

3．1 心电图筛查结果及患者资料总结

3．2 全外显子测序结果

3．3 家系内与家系外Sanger测序结果

3．4 突变查重

4 讨论

4．1 临床症状及心电图结果分析

4．2 突变结果讨论

4．3 方法讨论

5 结论

参考文献

综述 原发性心脏离子通道病的研究进展

攻读学位期间研究成果

致谢