PPARδ激动剂GW501516抑制人脐静脉内皮细胞表达MMP-2和细胞凋亡

摘要

研究背景:基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一类依赖锌离子和钙离子的内切酶家族成员,能特异性地与细胞外基质(extracellar matric,ECM)成分结合并降解细胞外基质。大量研究发现,MMPs在动脉粥样硬化病变的发展过程中发挥作用,如促进血管的新生、平滑肌细胞的迁移及表型改变、血管重塑、维持斑块稳定性等。MMP-2即Ⅳ型胶原酶,是MMPs家族的成员,能够降解Ⅳ型胶原和部分变性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原等细胞外基质,MMP-2的含量和活性与动脉粥样硬化斑块的形成和斑块的稳定密切相关。
　　PPARδ(peroxisome Proliferator-activated receptorδ)是过氧化物酶体增殖物激活型受体家族中的一员,广泛表达于多种器官和组织,主要控制脂肪组织和肌肉中脂肪酸氧化和能量解偶联,抑制巨噬细胞诱导的炎症,改善动脉粥样硬化,并参与许多疾病的发生和发展过程。PPARδ的配体分为天然配体和合成配体。GW501516是PPARδ的合成配体,属于苯氧乙酸衍生物,PPARδ与 GW501516结合后,活化的PPARδ与9-顺视黄酸类受体(9-cis retinoid X receptor,RXR)形成异二聚体,然后识别并于靶基因启动子上游的过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferator response element, PPRE)结合,调节靶基因下游的基因转录、翻译及生物学效应。本课题拟从细胞水平探讨PPARδ对oxLDL和高糖诱导的人脐静脉内皮细胞MMP-2表达及对内皮细胞功能的影响。
　　第一部分 PPARδ特异性激动剂GW501516对oxLDL、高糖诱导的人脐静脉内皮细胞MMP-2表达的影响
　　目的:观察 PPARδ激动剂 GW501516对 oxLDL、高糖诱导的人脐静脉内皮细胞MMP-2表达和对细胞凋亡及细胞增殖的影响。
　　方法:1.用不同浓度(0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)的oxLDL与HUVEC共孵育24小时;用不同浓度(0 mM、15 mM、30mM、45mM)的高糖与HUVEC共孵育24小时;用荧光定量PCR(Rea1-time PCR)检测细胞MMP-2 mRNA的表达。
　　2.不同浓度GW501516(0nM、1nM、10nM、100nM、1μM)预处理HUVEC1h,分别与50mg/L oxLDL或30mM高糖共孵育24h,空白组作为对照,用Western blotting和Rea1-time PCR分别检测细胞 MMP-2蛋白和mRNA的表达;用不同浓度GW501516(0nM、10nM、100nM、1μM)预处理HUVEC1h,分别与100 mg/L oxLDL或30mM高糖共孵育24h,空白组作为对照,采用流式细胞术检测细胞凋亡率;采用MTT法检测细胞的增殖。
　　结果:不同浓度oxLDL可诱导HUVEC MMP-2 mRNA的表达上调,浓度为50mg/L时MMP-2 mRNA的表达达峰值,不同浓度高糖可诱导HUVEC MMP-2 mRNA的表达上调,浓度为30mM时,MMP-2 mRNA的表达达峰值。不同浓度GW501516与oxLDL共孵育HUVEC24h,HUVEC MMP-2蛋白和mRNA水平表达均下调,呈剂量依赖性(P<0.05),不同浓度GW501516与高糖共孵育HUVEC24h,HUVEC MMP-2蛋白和mRNA表达下调,呈剂量依赖性(P<0.05)。不同浓度 GW501516分别与oxLDL、高糖共孵育HUVEC24h,流式细胞术检测细胞的凋亡率,oxLDL诱导的细胞凋亡率是21.3％,不同浓度GW501516处理组凋亡率分别为17.47%、9.72%、3.94%,高糖诱导的细胞凋亡率为22.65%,不同浓度GW501516处理组凋亡率分别为20.23%,17.01%,9.38%,结果显示GW501516可抑制oxLDL、高糖诱导的细胞凋亡。MTT法检测不同浓度GW501516可抑制oxLDL、高糖对细胞增殖的影响。
　　第二部分干扰RNA片段对人脐静脉内皮细胞PPARδ及MMP-2表达的影响
　　目的:研究干扰RNA片段对HUVEC PPARδ基因表达的影响,了解PPARδ基因表达量发生变化时,GW501516抑制oxLDL、高糖诱导的MMP-2作用是否发生变化,以探讨GW501516是否通过激活PPARδ通路参与调节人脐静脉内皮细胞MMP-2的表达。
　　方法:设计siRNA四条引物( NC591621972),采用siRNA干预体外培养的人正常脐静脉内皮细胞,脂质体转染24h后,荧光显微镜观察转染效率,用100 nM GW501516预处理转染后的HUVEC1h,然后分别与oxLDL50mg/L和高糖30mM共孵育24h,采用Real-time PCR及Western blotting法检测PPARδ和MMP-2 mRNA及蛋白质表达水平。
　　结果:针对PPARδ基因设计的siRNA三条引物(591621972)可沉默PPARδ的表达,其中621引物作用显著,转染后的HUVEC经GW501516预处理和oxLDL、高糖诱导后,MMP-2 mRNA和蛋白表达量均增多,结果表明,沉默PPARδ阻抑了GW501516对oxLDL、高糖诱导HUVEC MMP-2表达的抑制作用。
　　结论:
　　1. PPARδ特异性激动剂GW501516抑制oxLDL和高糖诱导的HUVEC MMP-2的表达;
　　2. PPARδ特异性激动剂GW501516阻抑oxLDL和高糖诱导的内皮细胞凋亡及对细胞增殖的影响;
　　3.采用siRNA技术沉默PPARδ基因,阻抑GW501516对HUVEC MMP-2的下调作用。

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前言

第一部分 PPARδ特异性激动剂GW501516对oxLDL和高糖诱导的内皮细胞MMP-2表达的影响

材料与方法

1.主要试剂及配制

2.主要仪器

3. 原代细胞培养[23]

4．细胞分组

6. 实时定量逆转录-聚合酶链反应检测MMP-2 mRNA的表达

7. Western blotting检测MMP-2蛋白质的表达

8. 流式细胞仪检测细胞凋亡

9. MTT法检测细胞增殖

10.统计学处理

实验结果

1. oxLDL、高糖对人脐静脉内皮细胞MMP-2 mRNA表达的影响

2.不同浓度GW501516对oxLDL、高糖诱导的HUVEC MMP-2 mRNA和蛋白表达的影响

3. 流式细胞术检测HUVEC AnnexinV的表达

4 MTT法检测细胞增殖

小结

第二部分 siRNA对HUVEC PPARδ及MMP-2表达的影响

材料与方法

1．材料

2．方法

实 验 结 果

1. 荧光显微镜对siRNA转染效率的鉴定

2.各基因熔解曲线分析

3. siRNA对GW501516和oxLDL处理的HUVEC PPARδ表达的影响

4. siRNA对GW501516和oxLDL处理HUVEC MMP-2 表达的影响

5. siRNA 对GW501516和高糖处理的HUVEC PPARδ表达的影响

6. siRNA对GW501516和高糖处理的HUVEC MMP-2表达的影响

小结

讨论

结论

参考文献

英文缩略语索引

综述

硕士期间发表的论文

致谢