黄荆子乙酸乙酯提取物联合顺铂诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡作用的实验研究

摘要

目的：观察黄荆子乙酸乙酯提取物(the acetoacetate extract of Vitex negundoseed，Evn-50)及其与顺铂(cisplatin DDP)合用在体外对人卵巢癌CoC1细胞凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。 方法：体外培养CoC1细胞，以终浓度为1.0、10.0、100.0 mg/L的Evn-50及终浓度为0.2、2.0mg/L的DDP，终浓度为1.0、10.0、100.0 mg/L的Evn-50分别与终浓度为0.2mg/L的DDP联合处理人卵巢癌CoC1细胞，并设空白对照组、溶媒对照组，台盼蓝排斥试验测定各组对CoC1细胞增殖的影响；软琼脂克隆形成法检测其对体外培养CoC1细胞的锚定非依赖性生长作用；AO/EB染色法荧光显微镜观察各组诱导CoC1凋亡细胞的形态学改变；DNA凝胶电泳确证各组诱导CoC1细胞凋亡作用；PI染色流式细胞术(FCM)定量分析各组诱导CoC1细胞凋亡程度及对细胞周期的影响；FITC流式细胞术初步探讨其诱导凋亡的机制。 结果：台盼蓝排斥试验结果显示：以终浓度为1.0、10.0、100.0 mg/L的Evn-50及终浓度为0.2、2.0mg/L的DDP，不同浓度的Evn-50与终浓度为0.2mg/L的DDP分别处理人卵巢癌CoC1细胞48小时，其细胞增殖相对抑制率分别为46.96％±6.71％、61.01％±6.86％、65.53％±12.71％、4.89％±2.37％、47.98％±12.05％，62.68％±8.91％、71.32％±10.33％、81.95％±22.47％呈剂量依赖性抑制CoC1细胞增殖，IC50值为1.43mg/L。且两药合用明显高于同剂量单用组(P<0.05)。软琼脂克隆形成法的结果显示，Evn-50(1.0、10.0、100.0 mg/L)，DDP(0.2mg/L，2.0mg/L)及其二者联合处理的人卵巢癌CoC1细胞后仅EVn-501.0mg/L组及DDP0.2mg/L组有克隆形成，且数量明显减少，与空白对照组溶媒对照组相比，有统计学意义(P<0.05)，即Evn-50(1.0、10.0、100.0)mg/L，DDP(0.2、2.0)mg/L及两药联用后体外培养CoC1细胞的锚定非依赖性明显减弱。AO/EB染色荧光显微镜观察CoC1细胞经各药物组处理后，部分呈现典型凋亡细胞形态特征，镜下计数各组细胞数，并计算其凋亡率，发现Evn-5010.0mg/L组与DDP2.0mg/L组凋亡率接近，而Evn-50100.0mg/L组的凋亡率略高于DDP2.0mg/L组(P<0.05)。Evn-50(1.0、10.0、100.0)mg/L处理CoC1细胞24h，48h，72h琼脂糖凝胶电泳呈现“梯形”DNA条带。PI染色流式细胞光度术检测结果显示：在凋亡率方面，溶媒对照组为3.83±0.47％：终浓度为1.0 mg/L Evn-50，10.0 mg/L Evn-50，100.0mg/L Evn-50处理组分别为11.77±0.71％，36.94±14.8％，66.74±6.71％，终浓度为2.0 mg/L DDP处理组为48.73±3.91，Evn-50(1.0、10.0、100.0)mg/L组与0.2mg/L DDP合用后，COC1的凋亡率分别达78.7±2.80％，83.63±2.91％，85.87±1.39％，明显高于它们单用的效果；在细胞周期分析方面，空白及溶媒对照组细胞在处理24h，48h，72h时G1，S，G2/M期分布没有明显改变。终浓度为1.0 mg/L Evn-50，10.0 mg/L Evn-50，100.0 mg/L Evn-50作用COC1细胞48h，G2/M期细胞百分率分别为6.4％，34.7％，38.1％，与空白及溶媒对照组相比P<0.05，并呈剂量依赖性关系P<0.05。而终浓度0.2，2.0 mg/L DDP作用COC1细胞48h后G1/S期细胞百分率分别为49.7％，52.3％，与空白及溶媒对照组相比P<0.05。FITC染色FCM分析结果显示：Evn-50(1.0、10.0、100.0 mg/L)处理细胞48小时后高浓度组与低浓度组比较，CoC1细胞Bcl-2蛋白表达下调11.03％，Bax蛋白表达上调96.83％，Caspase-3蛋白表达上调13.45％。 结论： 1)Evn-50能抑制体外培养人卵巢癌CoC1细胞生长，呈浓度和时间依赖性； 2)Evn-50具有诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡作用； 3)Evn-50可以增强DDP诱导人卵巢癌COC1细胞凋亡的作用； 4)Evn-50与DDP在诱导人卵巢癌COC1细胞凋亡中将细胞周期阻滞在了不同的阶段； 5)Evn-50抑制人卵巢癌细胞生长和诱导其凋亡作用可能与其下调Bcl-2、上调Bax、caspase-3蛋白表达相关。