奥曲肽及其联合顺铂对人卵巢癌细胞SKOV3增殖抑制作用以及诱导细胞凋亡的实验研究

摘要

目的：研究奥曲肽（Octreotide，OCT）及其与顺铂（DDP）两种药物联合应用在体外抑制人卵巢癌细胞SKOV3增殖作用的有效性，初步探讨其对卵巢癌细胞生长抑制、凋亡诱导、形态改变及顺铂敏感性方面的影响及作用机制，为临床应用奥曲肽作为治疗卵巢癌的一种辅助抗癌药物提供实验依据和理论依据。
　　 方法：
　　 1.以体外培养的人卵巢癌细胞SKOV3为研究对象，不同剂量的OCT、DDP及两药联合作用于SKOV3细胞，采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法测定细胞光密度值（optical density，OD），计算生长抑制率：a.顺铂、奥曲肽单药对SKOV3细胞增殖的影响以及奥曲肽对人正常成纤维细胞株HF细胞增殖的影响；b.顺铂联合奥曲肽对SKOV3细胞增殖的影响；c.奥曲肽对SKOV3细胞顺铂半数抑制浓度（IC50）的影响。
　　 2.细胞增殖生长反应及传代实验。
　　 3.卵巢癌SKOV3细胞。DNA的琼脂糖凝胶电泳分析。
　　 4.流式细胞仪分析奥曲肽、顺铂及两药联合对SKOV3细胞周期分布的改变，及其对细胞凋亡的影响。
　　 5.经瑞氏-吉姆萨复合染色后光学显微镜下观察SKOV3细胞用药前后的形态学改变。
　　 6.透射电镜下观察SKOV3细胞用药前后的超微结构改变。
　　 结果：
　　 1.不同浓度的奥曲肽和顺铂单独用药和联合用药可抑制SKOV3细胞的生长，并且具有较明显的时间-剂量依赖关系，抑制作用随着药物浓度的提高、作用时间的延长而逐渐增强，有统计学意义（P<0.05）；同时从实验结果中能够观测到各浓度OCT与DDP联合用药对卵巢癌细胞的生长抑制率均比各相应的单独用药组显著增强，1～8ug/ml的奥曲肽可协同顺铂对SKOV3细胞增殖的抑制作用，且随着奥曲肽浓度的增大，其与顺铂的协同作用亦逐渐增强；奥曲肽、顺铂单药的IC50分别为10.41 ug/ml和9.84ug/ml，4种不同浓度的奥曲肽（0.5、1、4、8ug/ml）分别与顺铂联用后顺铂的IC50明显降低，与单用顺铂组比较，4种不同浓度的奥曲肽可使顺铂的IC50分别降低到7.48ug/ml、5.2ug/ml、3.64ug/ml、1.22ug/ml。
　　 2.光学显微镜下观察正常SKOV3细胞呈长梭形或多边形，细胞形态饱满，呈丛簇状排列，生长旺盛；经奥曲肽作用后，细胞轮廓增强，反差增大，胞质粗糙，内有颗粒物沉积，部分细胞脱壁死亡，以上变化随作用时间的延长而逐渐明显。顺铂与奥曲肽的作用相似。阴性对照细胞和HF细胞无任何变化，正常生长。传代实验表明，加入奥曲肽的HF细胞和未加药的SKOV3细胞均可正常传代，而加药的SKOV3细胞则不能传代。表明奥曲肽可明显抑制SKOV3细胞的增殖生长反应，且经药物作用后，细胞失去传代能力，而对正常的HF细胞无影响。
　　 3.SKOV3细胞在4、8ug/ml的奥曲肽培养48h后进行DNA琼脂糖凝胶电泳发现，对照组中提取的DNA集中在加样孔附近出现一条清晰的条带，为完整基因组DNA的表现。而4、8ug/ml的奥曲肽处理组中提取的DNA均在加样孔后出现了典型的梯状条带，提示细胞DNA降解为有规律大小的片段。
　　 4.经1、4ug/ml奥曲肽、5ug/ml顺铂及两药联合作用48h后的SKOV3细胞，随着奥曲肽浓度增加，S期细胞有增多趋势，奥曲肽使细胞阻滞于S期；5ug/ml顺铂处理组出现G1期细胞减少，S期细胞增多，使细胞阻滞于S期；两药联合应用时，随着奥曲肽浓度增加，出现较明显的S期阻滞，G0/G1期和G2/M期细胞均出现不同程度减少。且凋亡率也相应增高，细胞凋亡百分率分别为1.4％±0.09％、15.5％±0.57％、6.27％±1.43％、11.64％±1.76％、36.61％±2.03％、45.76％±3.32％。
　　 5.经瑞氏-姬姆萨复合染色光学显微镜下观察：对照组SKOV3细胞呈长梭形或多边形，细胞形态饱满，胞质丰富，胞核居于细胞中央，染色均匀，核仁清晰可见，生长旺盛；而经奥曲肽作用48h后，贴壁的正常细胞减少，细胞皱缩呈圆形或卵圆形，胞质浓缩，核着色不均匀，嗜酸性增加，核染色质浓集成紫蓝色致密的球状。
　　 6.透射电镜下观察SKOV3细胞的形态显示：未经处理的SKOV3细胞形态较大，呈梭形，胞膜完整，表面有大量绒毛样突起。细胞核大，形态不规则，有1-3个核仁，内染色质丰富，无明显染色质边集，细胞质内细胞器丰富，可见内质网、线粒体、溶酶体等细胞器；各实验组可呈现不同程度的凋亡细胞的典型形态学特征，尤以联合组变化显著。部分SKOV3细胞明显缩小，细胞表面微绒毛显著减少甚至消失。胞浆内结构密度增大，内质网和线粒体等细胞器可辨认，其数目减少。细胞核内染色质浓集成块，电子密度增高，有的呈新月形或帽状改变，边集在核膜下。
　　 结论：
　　 1.奥曲肽对人卵巢癌细胞SKOV3的增殖具有明显的抑制作用，呈时间-剂量依赖效应，而对SKOV3细胞产生抑制作用剂量的奥曲肽对正常HF细胞无影响，可见奥曲肽应用于卵巢癌的辅助治疗具有可行性。
　　 2.与顺铂联合应用可增强顺铂对SKOV3细胞增殖的抑制作用，并可提高卵巢癌对顺铂的敏感性。
　　 3.奥曲肽处理后的SKOV3细胞的DNA降解为有规律大小的片段，在DNA琼脂糖凝胶电泳上表现为较典型的梯状条带。
　　 4.奥曲肽在干扰SKOV3细胞周期和诱导凋亡方面表现为阻滞肿瘤细胞于S期；DDP使SKOV3细胞阻滞于S期，两药联合表现为显著协同效应，可能是其增敏的重要机制。

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综述 生长抑素抗肿瘤机制及其对卵巢癌的治疗展望

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