奥曲肽联合顺铂对人卵巢癌细胞SKOV3的增殖抑制及其对VEGF与P-gp表达的影响

摘要

目的：卵巢上皮性肿瘤是最常见的卵巢肿瘤，其恶性类型占卵巢恶性肿瘤的85％～95％，而卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，死亡率居妇科肿瘤的首位。传统的三大治疗方法虽有一定进步，但因临床症状隐匿，早期诊断困难，晚期病人疗效不佳。目前卵巢癌的治疗仍难以令人满意。研究表明血管生成是实体肿瘤生长和转移的必备条件，而且与腹水生成有关。肿瘸和宿主组织均可产生多种血管生成因子，他们相互作用参与肿瘤血管形成的各个阶段。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种主要的血管生成因子，VEGF与其受体结合后，通过一系列信号转导途径促进肿瘤血管形成。目前，化疗仍是除手术治疗之外的重要治疗手段之一。研究发现，导致肿瘤化疗失败的原因之一是肿瘤对化疗药物的多药耐药。多药耐药是指由一种药物诱发，对该药耐药的同时，对其结构和作用机制无关的化疗药物产生交叉耐药。P-gp（P-glycoprotein）是多药耐药基因1（multidrug resistance gene1，MDR1）编码的一种跨膜转运蛋白，具有ATP酶活性，能将化疗药物从细胞内泵出，降低细胞内的有效药物浓度而致多药耐药。本文研究奥曲肽（octreotide，OCT）与顺铂单用及合用对体外培养的SKOV3卵巢癌细胞生长的影响及检测VEGF与P-gp的表达，初步揭示其在血管方面的作用机制及耐药性研究。探讨奥曲肽用于卵巢癌临床治疗的可行性。
　　 方法：
　　 1.人卵巢癌细胞SKOV3的培养、传代以及生长曲线的测定。
　　 2.体外培养人卵巢癌细胞SKOV3，采用四甲基偶氮唑蓝（tetrzolium-based colorimetric assay，MTT）比色法检测奥曲肽对该细胞增殖的抑制作用。
　　 3.MTT比色法检测奥曲肽与顺铂联合应用后对SKOV3细胞的抗增殖作用，采用金氏公式[1]分析相互作用指数（Interaction Index），评价两药联合应用后的作用，如相互作用指数>0.85表示相加作用，相互作用指数<0.85为拮抗作用。
　　 4.倒置显微镜和H-E染色法观察细胞的形态学变化。
　　 5.应用免疫细胞化学方法检测VEGF、P-gp的表达。
　　 6.奥曲肽对人卵巢癌细胞SKOV3侵袭的影响。
　　 结果：
　　 1.在无药物干预下，SKOV3细胞生长迅速，加入奥曲肽后细胞生长相对减慢，且随奥曲肽浓度增大，细胞生长曲线更趋低平。
　　 2.MTT比色法表明，奥曲肽能抑制人卵巢癌细胞SKOV3的体外生长，不同浓度的奥曲肽（0.1、0.5、1、5、10μg/ml）对SKOV3细胞的增殖均可产生抑制作用，且随浓度的增加，抑制作用逐渐增强，而且随着奥曲肽作用时间的延长，抑制作用也逐渐增强，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。即奥曲肽对SKOV3细胞增殖的抑制作用在一定的浓度范围内呈明显的时间-剂量依赖关系。
　　 3.将奥曲肽与顺铂联合后发现对SKOV3细胞的增殖有明显的抑制作用，均大于奥曲肽或顺铂单用的效果。本文采用0.5、1、5μg/ml的奥曲肽与1.25、2.5、5μg/ml的顺铂联合应用，发现随着奥曲肽浓度的增大，其与顺铂的相加作用亦逐渐增强。金氏公式分析相互作用指数表明，0.5、1、5μg/ml的奥曲肽联合不同浓度的顺铂其相互作用指数均>0.85，说明两药台用后，其疗效具有相加的作用。
　　 4.倒置显微镜下观察对照组SKOV3细胞贴壁生长良好，呈长梭形或菱形，透明，形态饱满，细胞增生活跃；而经奥曲肽作用48小时后的部分细胞不贴壁，皱缩，破裂，呈不规则形。经H-E染色后观察，对照组SKOV3细胞还可见细胞核染色均匀，而经药物作用后，SKOV3细胞出现形态变圆，体积缩小，胞质浓缩等现象。
　　 5.免疫细胞化学结果显示，VEGF蛋白主要定位于细胞浆，呈棕黄色。对照组中，VEGF蛋白在SKOV3细胞浆中呈强表达；经药物处理48小时后，VEGF蛋白的染色明显减弱（P<0.05）。P-gp蛋白定位于胞浆与胞膜，呈棕褐色颗粒，在未用药的SKOV3细胞的细胞膜和胞浆中也呈阳性表达，经各浓度奥曲肽处理后，表达均减弱，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　 6.奥曲肽对人卵巢癌细胞SKOV3侵袭的影响，对照组穿膜细胞数为146个/400倍视野，经作用24小时后，浓度分别为5μg/ml和10μg/ml的奥曲肽的穿膜细胞数分别为82个/400倍视野和35个/400倍视野。
　　 结论：
　　 1.奥曲肽对体外培养的人卵巢癌细胞SKOV3的生长有抑制作用，为卵巢癌的临床治疗提供了一种新的手段。
　　 2.奥曲肽抑制SKOV3细胞增殖的作用在一定的浓度范围内呈明显的时间-剂量依赖关系。
　　 3.奥曲肽和顺铂联合应用对人卵巢癌细胞SKOV3的抑制作用增强，强于两者的单独应用，具有协同效应。
　　 4.奥曲肽能使SKOV3细胞中VEGF蛋白表达下调，说明其抗肿瘤作用可能与其抑制肿瘤血管的形成有关。
　　 5.奥曲肽能下调SKOV3细胞中P-gp蛋白的表达水平，说明可能与其对抗肿瘤细胞的耐药性有关。
　　 6.奥曲肽随着其浓度的增加，抑制细胞的侵袭能力也逐渐增强。

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结论

参考文献

综述 多药耐药系统及血管内皮生长因子系统与卵巢肿瘤的研究进展

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