ARL-1基因沉默及基因定点突变对丙烯醛代谢的影响

摘要

目的 1、构建ARL-1siRNA慢病毒载体，并鉴定其功能；通过酶活性分析方法检测细胞内ARL-1对丙烯醛代谢的变化。 2、明确ARL-1具有催化活性的位点，并用丙烯醛做底物，检测其代谢变化 方法 1、ARL-1基因沉默对丙烯醛代谢的影响 按照Lentiviral RNAi Experssion System说明书提供的方法设计合成针对ARL-1的siRNA慢病毒载体；选用ARL-1具有较高内源性表达的HCT8细胞作为病毒感染模型，提取总蛋白，Western-blot检测细胞内ARL-1的表达水平；通过酶活性分析方法检测细胞内ARL-1对丙烯醛代谢的变化。 2、ARL-1基因定点突变对丙烯醛代谢的影响 设计引物，甲基化定点突变将赖氨酸(78)突变为谷氨酸；再将突变质粒进行两次转化，用不同浓度的IPTG诱导突变质粒在M15大肠杆菌中大量表达；提取细菌蛋白进行蛋白纯化，用丙烯醛做底物检测其动力学的变化情况。 结果 1、以ARL-1cDNA作为靶序列设计的siRNA，将其与pENTRTM/U6连接，建立了连接产物pENTRTM/U6 siRNA和plenti6/BLOCK-iTTM慢病毒表达质粒的L-R重组反应体系；将siRNA慢病毒表达载体质粒和病毒包装质粒通过阳离子脂质体介导的方法共转染入病毒包装细胞293T细胞中，成功的构建了ARL-1 siRNA慢病毒载体，该病毒载体能有效抑制HCT8细胞内ARL-1蛋白的表达，增加细胞对丙烯醛的敏感性。 2、对醛糖还原酶类似蛋白酶-1(ARL-1)的cDNA序列进行定点突变，即将赖氨酸(78)编码序列突变为谷氨酸的编码序列，质粒PQE-ARL-1经测序证实碱基得到了成功突变，酶活性分析发现，突变后的ARL-1对底物丙烯醛物质的代谢有重要的影响。 结论 1、成功构建了能有效抑制细胞内ARL-1表达的ARL-1 si RNA慢病毒载体，ARL-1-siRNA慢病毒感染引起的ARL-1蛋白水平下调，增加细胞对丙烯醛的敏感性。 2、ARL-1蛋白中赖氨酸(78)突变为谷氨酸降低了ARL-1对丙烯醛的还原活性，说明赖氨酸(78)是ARL-1蛋白中与酶活性密切相关的活性位点。