慢性温和应激加速动脉粥样硬化病变形成及Toll样受体4途径的作用研究

摘要

背景：动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性免疫炎症性疾病，高血脂、高血压、肥胖等传统的心血管疾病危险因素只能解释约40－50％的AS患者的患病的病理生理学机制，大约40％的没有传统的危险因素的AS患者则与慢性应激有关。虽然有越来越多的临床流行病学研究资料表明慢性温和应激（chronic mild stress, CMS）在AS性病变中有着重要作用，但对其在AS发生与发展中的作用机制至今尚未阐明。研究表明，CMS应激还能诱发机体的慢性免疫炎症应答，但对其导致慢性炎症发生的分子机制有待进一步的研究。鉴于通过人体研究资料来阐释CMS在AS性疾病发生与发展中的作用及其机制存在诸多的限制因素，因此，建立适当的CMS动脉粥样硬化动物模型来探讨其在AS中的作用机制显得尤为重要。由于apoE-/-小鼠对CMS应激敏感性好；能自发性地发生AS病变，且其好发AS病变的部位和性质与人类AS极其相似，因此本研究采用CMS apoE-/-小鼠模型来研究CMS在AS发生、发展中的作用及其免疫学机制。
　　天然免疫在AS性疾病的发生与发展、在CMS诱导的应激反应中都有着重要作用。天然免疫通过识别被称为病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的高度保守抗原域，是机体抵御微生物入侵的第一道屏障。Toll样(Toll-like receptor，TLR)识别种类繁多的PAMP，属于模式识别受体。目前人类TLR家族至少有10名成员已被发现。TLRs与配体结合后激活NF-κB等信号转导通路，诱导炎性细胞因子的转录（如TNF-α），进一步激活细胞的免疫功能。实验提示：TLR4是连接免疫、脂质代谢与AS的桥梁；在慢性应激所致的免疫应答中也可能有着重要作用。因此，本研究通过建立CMS apoE-/-AS小鼠模型来探讨CMS对AS的发生与发展的影响，及其TLR4途径在该模型小鼠AS发生、发展当中的作用和机制。
　　目的：
　　1.慢性温和应激能否加速apoE-/-小鼠AS的发生与发展。
　　2.慢性温和应激对apoE-/-小鼠主动脉TLRs信号通路基因表达的影响。
　　3.构建Ad-TLR4 siRNA干扰载体并转染apoE-/-小鼠，研究TLR4 siRNA干扰对CMS apoE-/-小鼠主动脉AS发生、发展的影响及其对主动脉TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α基因表达的影响。
　　方法：
　　1.慢性温和应激apoE-/-AS小鼠模型的建立及其TLRs信号通路基因表达研究
　　1.1 实验动物应激方案4周龄apoE-/-小鼠120只平衡一周后随机分为2组：对照组（control组）和慢性温和应激组（chronic mild stress，CMS组）；每组60只。实验动物都以高脂、高胆固醇饲料（5％猪油，1％的胆固醇）的喂养。本实验所采用的应激方案在Ipek Yalcin等建立的慢性应激模型基础上进行了改进，具体应激方案如下：垫料用水打湿17h（每周1次）；昼夜颠倒7或17h（每周2次）；鼠笼倾斜成45度角7或17h（每周2次）；噪声刺激9或15h（每周2次，80dB）；恐惧刺激1h（放入大鼠刚住过鼠笼、每周2次）。应激试验组小鼠按顺序接受每个应激源的刺激。应激组的小鼠分别在接受应激刺激0周（n＝20），4周（n＝20），12周（n＝20）3个时间点处死动物。对照组的小鼠关在单独的实验动物房，除了不给予应激刺激外，其它的实验条件与应激组相同。分别在试验开始后的第0，4，12周3个时间点处死动物。
　　1.2 糖皮质激素浓度与蔗糖偏嗜度测定所用apoE-/-小鼠首先接受训练饮用1％的蔗糖水：在开始的48h内将蔗糖水放入鼠笼中以代替灭菌的蒸馏水，接着禁食禁水8h，通过称饮水瓶前后重量，连续测量3次动物在1h内的饮水量，计算方式如下：
　　饮用1％蔗糖水重量＝饮用前饮水瓶的重量-饮用1h后饮水瓶的重量此后每周进行一次8h禁食禁水和1h饮蔗糖水测试。采用125I-皮质酮放射性免疫检测试剂盒测定血浆皮质酮的含量，此过程贯穿于整个实验。
　　1.3 CMS对apoE-/-小鼠主动脉AS病变面积测定从腹主动脉分叉至主动脉弓将主动脉剪下，干净剔除主动脉血管外的脂肪组织后，将主动脉树纵向剪开，主动脉树以用苏丹Ⅳ染色观察整个主动脉的病变。主动脉窦连续10μm冰冻切片进行油红O染色，观察主动脉AS病变。
　　1.4 CMS对apoE-/-小鼠TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α基因表达水平的测定Real-time PCR芯片分析apoE-/-小鼠主动脉TLRs信号途径基因表达；Western blotting方法检测apoE-/-小鼠主动脉TLR4和NF-κB的表达水平，免疫组化染色观察主动脉窦AS病变处TLR4的表达；ELISA法检测apoE-/-小鼠血清中的MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α表达水平。
　　2.Ad-TLR4 siRNA干扰对CMS apoE-/-小鼠主动脉AS发生、发展及其对主动脉TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α基因表达的研究
　　2.1 Ad-TLR4 siRNA干扰载体构建
　　2.1.1 有效封闭TLR4表达的小分子干扰RNA载体构建设计、合成两对特异性针对TLR4基因的小分子干扰RNA序列，分别构建小分子干扰RNA载体 pRNAT-TLR4-1和pRNAT-TLR4-2；阴性对照为pRNAT-H1.1/Adeno空载体。DNA测序鉴定重组质粒的正确性。
　　2.1.2 有效封闭TLR4表达的小分子干扰RNA载体筛选收集稳定筛选获得的293A-Ad-siRNA-TLR4-1、293A-Ad-siRNA-TLR4-2和293A-pNeg细胞，抽提各组细胞的总RNA和总蛋白，分别以Real time-PCR与Western blotting法检测各组细中TLR4mRNA与蛋白的表达水平；选取对TLR4抑制率高的一对进行体外大量扩增。
　　2.1.3 小分子干扰腺病毒载体的体外扩增、滴度测定以上大量扩增获得的Ad-siRNA-TLR4-2、Ad-siRNA-Neg腺病毒以不同浓度感染293A细胞，逐孔稀释滴度测定法检测病毒滴度。
　　2.2 TLR4 siRNA干扰对CMS apoE-/-小鼠主动脉AS发生、发展影响的研究4周龄雄性apoE-/-小鼠120只平衡一周后随机分为3组：（1）CMS组；（2）CMS＋TLR4 siRNA组（10μl/只，尾静脉注射，每5日一次）；（3）CMS＋腺病毒空载体组。每组apoE-/-小鼠40只，实验动物都以高脂、高胆固醇饲料（5％猪油，1％的胆固醇）的喂养。分别在接受CMS刺激0，4，12周后3个时间点处死动物。主动脉窦连续10μm冰冻切片进行油红O染色，观察主动脉AS病变。
　　2.3 TLR4 siRNA干扰对 CNS apoE-/- TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α基因表达水平的测定分别以Real-time PCR方法检测apoE-/-小鼠主动脉TLR4和NF-κB mRNA表达水平；以Western blotting方法检测其主动脉TLR4和NF-κB蛋白质表达水平；ELISA法检测apoE-/-小鼠血清中的MCP-1、ICAM-1、IL-1β和TNF-α表达水平。
　　结果：
　　1.CMS显著升高apoE-/-小鼠血浆糖皮质激素水平结果显示：对照组小鼠血浆中皮质酮的浓度小于100ng/ml；CMS组apoE-/-小鼠应激4周后，CMS组小鼠血浆中的皮质酮激素的水平显著高于正常对照组；而应激12周后，CMS组小鼠血浆皮质酮激素浓度大约是对照组的11倍，与相应对照组相比，其血浆皮质酮激素浓度差异有非常显著（457.3±56.5 ng/ml vs40.2±7.2 ng/ml，P<0.001）。
　　2.CMS显著降低apoE-/-小鼠1%蔗糖水溶液摄取量结果表明：基线测试中应激组与对照组apoE-/-小鼠1％蔗糖水的饮用量没有差异（P>0.05）。在整个的实验时期内（12周），对照组小鼠的摄取蔗糖量没用明显的改变；而随着应激时间的增加，CMS组小鼠1％蔗糖水的饮用量逐渐显著减少。方差分析表明，CMS对apoE-/-小鼠1％蔗糖水的饮用量的改变有着显著作用[F(1,456)=236.47, P<0.01]。Two-Way ANOVN方差分析表明，随着应激时间的延长，CMS对apoE-/-小鼠1％蔗糖水的饮用量明显存在着应激×时间的交互作用[F(12,456)=141.42, P<0.001]。
　　3.CMS显著加速apoE-/-小鼠主动脉树AS病变的发生与发展研究结果表明：0周时，应激组与对照组的小鼠主动脉都未发生AS病变；接受4周、12周CMS刺激后的apoE-/-小鼠主动脉AS病变的面积占整个主动脉树面积的百分比分别为10.37％±2.32％和24.58％±3.81％，而相应对照组小鼠主动脉AS病变的面积占整个主动脉树面积的百分比分别为2.61％±0.57％和6.36％±1.47％；应激组主动脉的AS病变与相应对照组相比，差异显著（P<0.01）。
　　4.CMS显著加速apoE-/-小鼠主动脉窦AS病变的发生与发展结果表明：在实验刚开始时（0周），应激组与对照组apoE-/-小鼠主动脉窦都未发生AS病变；而经过4、12周的高脂、高胆固醇的饮食喂养后，对照组与应激组apoE-/-小鼠的主动脉窦都出现AS病变，随着时间的增加，主动脉窦AS病变显著加重。apoE-/-小鼠接受4、12周CMS刺激后，其主动脉窦AS病变与相应对照组相比较，应激组的AS病变显著加重。CMS应激12周apoE-/-小鼠主动脉窦的AS病变的面积为0.24±0.03 mm2，而相应对照组apoE-/-小鼠主动脉窦的AS病变面积仅为0.05±0.01 mm2。二者AS病变面积相比较，有显著差异（P<0.01）。
　　5.CMS对apoE-/-小鼠主动脉TLRs信号途径基因表达的影响实验结果表明：在TLR蛋白信号转导Real-time PCR芯片检测的83个基因当中，与对照组相比较，应激组当中apoE-/-小鼠主动脉的TLRs信号转到途径中的43个基因发生了显著性的改变，二者相比差异显著，有显著统计学意义；其中15表现为上调，28个表现下调。在共9个TLR样受体基因表达中，与相应对照组相比较，应激组的TLR4基因表达增加4倍多，而其它8个TLR样基因表达减少或不变，这说明CMS对apoE-/-小鼠主动脉TLRs的基因表达有差异。CMS诱导的TLR4信号转导途径激活后的基因表达中，IL-1β、TNF-α和IL-6的表达显著增加；其中IL-1β的表达增加了10倍多，与对照组相比，差异显著（P＝0.008）。
　　6.CMS对apoE-/-小鼠主动脉TLR4蛋白表达的影响0周时，对照组与CMS应激组apoE-/-小鼠的主动脉TLR4蛋白表达都比较少（0.21±0.03 vs0.22±0.05），对照组与应激组apoE-/-小鼠主动脉TLR4蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。给予4周CMS刺激后，对照组与应激组apoE-/-小鼠主动脉TLR4蛋白表达差异有统计学意义（0.25±0.08 vs0.74±0.06，P<0.05）。12周时，对照组与应激组apoE-/-小鼠主动脉 TLR4蛋白表达差异有统计学意义（0

目录

中文摘要

英文摘要

主要英文缩略语索引

第一部分 慢性温和应激对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变发生

前 言

1.材料与方法

2. 实验结果

3. 讨论

4. 结论

参考文献

第二部分TLR4 siRNA抑制CMS apoE-/-小鼠AS病变的发生和发展

前言

1. 材料与方法

2. 实验结果

3. 讨论

4. 结论

参考文献

综述

攻读博士学位期间发表论文

致谢