二肽基肽酶-Ⅳ在慢性应激性动脉粥样硬化形成中的作用及其机制研究

摘要

目的:　　当今社会，应激与疾病的关系越来越密切，长期暴露于各种社会心理应激状态下，是心血管疾病发生的一个重要危险因素。有研究发现二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-Ⅳ)能够通过胰高血糖素-1(GLP-1)依赖与非依赖途径参与体内多种疾病的发生与发展过程，包括炎症性生疾病、代谢综合征以及心血管系统疾病。我们的前期研究发现，慢性生应激可以使血DPP-Ⅳ活性增加，从而引起一系列病理生理学改变。因此本研究目的如下:1）探讨慢性应激在高脂饮食诱导ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化形成中的作用及可能机制;2）研究DPP-Ⅳ/GLP-1平衡在慢性应激性动脉粥样硬化形成过程中的变化;3.应用DPP-Ⅳ抑制剂（阿拉格列汀），阐明DPP-Ⅳ抑制剂的抗应激性动脉粥样硬化作用及其机制。　　方法:　　一、动物实验　　实验1:实验选取4周龄大小雄性ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠30只，正常饮食、环境饲养2周。适应环境后随机分为两组，高脂饮食对照组(HF-C组，n=15只)仅给予高脂饮食，建立动脉粥样硬化模型。高脂饮食应激组(HF-S组，n=15只)，给予高脂饮食同时给予不同形式的慢性限制性应激刺激。实验进行12周，留取两组小鼠血液、骨髓、腹股沟区皮下脂肪、内脏脂肪、心脏及整个主动脉样本。(1)应用HE染色、免疫组织化学染色、β-半乳糖(β-Gal)染色及油红染色等方法评对比性生应激对两组小鼠动脉粥样硬化斑块面积、炎症细胞浸润、脂质聚集、细胞外基质(ECM)降解情况以及血管老化等多个方面的影响;(2)应用流式细胞术(FCM)评估慢性应激对骨髓祖细胞及造血干细胞的动员情况;(3)应用ELISA法测定两组小鼠血脂联素(APN)、瘦素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)等指标的水平;生化检测低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血肌酐、尿素氮和非酯化脂肪酸等指标;(4)应用氨基荧光素底物发光法测定血DPP-Ⅳ活性，光泽精增强化学发光法测定NADPH活性;(5)应用PCR及Western Blot等方法测定GLP-1、APN、过氧化物酶体增殖体激活受体-α(PPAR-α)、血管紧张素ⅡⅠ型受体(ATR1)、CXC趋化因子受体4(CXCR4)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、组织蛋白酶(Cat)K、CatS、NADPH氧化酶亚基(gp91phox、P47phox、P67phox)、P-AMPK、P21、P16INK4A以及Toll样受体2和4等相关指标基因蛋白表达情况;(6)应用明胶酶谱法测定基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9活性。　　实验2:实验选取4周龄大小雄性ApoE-/-小鼠28只，正常饮食、环境饲养2周。适应环境后随机分为2组。所有实验小鼠均给予高脂饮食饲养以形成动脉粥样硬化模型。应激组(Sress组，n=14只)再给予不同形式的慢性应激刺激12周。应激-DPP-Ⅳ抑制剂-阿拉格列汀组(S-Ana组，n=14只)给予应激刺激同时给予阿拉格列治疗12周。留取两组小鼠血液、骨髓、腹股沟区皮下脂肪、内脏脂肪、心脏及整个主动脉样本，采取和实验1同样的方法进行结果分析。　　实验3:实验选取4周龄大小雄性ApoE-/-小鼠10只，正常饮食、环境饲养2周。适应环境后随机分为2组。应激-阿滞列汀APN中和抗体组(S-Ana-NAPN组，n=5只)给予应激刺激和DPP-Ⅳ抑制剂基础上每周2次皮下注射APN中和抗体8周。应激-阿拉格列汀-APN中和抗体对照组(S-Ana-C组，n=5只)小鼠给予应激刺激和DPP-Ⅳ抑制剂基础上每周两次皮下兔IgG抗体8周，留取两组小鼠血液、骨髓、腹股沟区皮下脂肪、内脏脂肪、心脏及整个主动脉样本，采取和实验1同样的方法进行生化和组织学分析。　　二、细胞实验　　实验选取3T3-L1细胞进行体外传代及培养。细胞分为两大组:GLP-1受体(GLP-1R)激动剂-艾塞那肽组和DPP-Ⅳ抑制剂组-阿拉格列汀组。GLP-1R激动剂组再分为三个亚组，分别给予GLP-1R激动剂-艾塞那肽0nM、5nM和25nM三个剂量刺激3T3-L1细胞;DPP-Ⅳ抑制剂组同样分为三个亚组，分别给予阿拉格列汀0μM、10μM和20μM三个剂量刺激3T3-L1细胞。实验结束，通过PCR检测APN表达情况。　　结果:　　一、慢性应激对小鼠体重、血脂、体脂含量及血DPP-Ⅳ水平的影响。　　1.与HF-C组小鼠相比，HF-S组小鼠的体重明显下降，且呈时间依赖性生;同时，HF-S组小鼠皮下脂肪和内脏脂肪含量也明显减少。HF-S组小鼠血DPP-Ⅳ水平(649±13ng/mL vs997±40 ng/mL，P＜0.01)显著增加，同时伴有血APN、GLP-1水平下降，差异具有统计学意义。　　2.两组小鼠之间血CREA，BUN、LDL-C、HDL-C等指标水平没有显著性差异。　　二、慢性应激促进了饮食诱导的动脉粥样硬化形成、斑块不稳定及血管老化。　　1.与HF-C组小鼠相比，慢性应激促进了高脂饮食诱导的小鼠主动脉根部动脉硬化粥样斑块形成，扩大了斑块新生内膜面积(284±14×103/μm2 vs557±21×103/μm2，P＜0.05)，增加了斑块内膜与中膜面积的比例（1.3±0.1 vs2.3±0.2，P＜0.05），差异均具有统计学意义。　　2.慢性应激促进了斑块内炎症反应。免疫组化结果显示:与非应激组比较，应激组小鼠斑块内巨噬细胞、骨桥蛋白表达及新生血管数均明显增加(22.8±1.7％ vs34.5±2.4％;23.6±1.2％vs30.4±1.0％;5.6±0.9％ vs9.3±1.3％;P值均＜0.05);同时，炎症相关指标TLR-2、TLR-4、CXC趋化因子受体4(CXCR4)、组织蛋白酶(Cat)K、CatS、PPAR-α的基因表达也明显增多。　　3.慢性应激促进了斑块内氧化应激反应。还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性检测结果显示:与HF-C组比较，HF-S组小鼠NADPH氧化酶活性明显增加（130.2±7.8 RLU/mgvs.210.0±15.1 RLU/mg，P＜0.05）。相应的NADPH氧化酶亚基(gp91phx、P47phox、P67hox)的基因或蛋白表达也明显增高。　　4.慢性应激促进了细胞外基质(ECM)的降解。免疫组化结果显示:与HF-C组比较，HF-S组小鼠动脉粥样硬化斑块内胶原纤维和平滑肌细胞含量明显减少（32.1±1.3％ vs18.5±2.3％;27.3±1.0％ vs24.4±0.6％;P值均＜0.05）。同时伴有MMP-2、MMP-9、CatK和CatS的表达或活性的增强。　　5.慢性生应激促进了血管的老化。β-Gal染色血管老化定量分析显示，与HF-C组相比，慢性应激组小鼠血管老化染色阳性区域更加显著(13.5±2.1×103/μm2 vs33.5±3.5×103/μm2，P＜0.05);相应的，凋亡相关基因p16NK4A和p21的蛋白表达也明显增强。　　三、DPP-Ⅳ抑制剂延缓了慢性应激所致的动脉粥样硬化形成及血管老化过程。　　1.应用DPP-Ⅳ抑制剂-阿拉格列汀后明显改善了应激性动脉粥样硬化病变程度。与HF-C组比较，DPP-Ⅳ抑制降低了血DPP-Ⅳ水平(976±4ng/mLvs477±22ng/mL，P＜0.01)，缩小了新生内膜面积(506.0×103/μm2±22.0 vs147.0±12.0×103/μm2，P＜0.05)，差异均有统计学意义。　　2.与HF-C组相比，应用DPP-Ⅳ抑制剂后，显著抑制了动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞的浸润、脂质沉积、新生血管的形成、弹性生纤维的破坏，延缓了血管内皮的损伤及老化、并增加了斑块内胶原纤维的含量。与此同时抑制了TLR-2和TLR-4、CXCR4、CatS和CatK、骨桥蛋白、PPAR-α、基因p16INK4A、gp91phox、P47phox、P67phox等的mRNAs和/或蛋白的表达。差异均有统计学意义。　　3.APN中和抗体实验结果显示:应用APN中和抗体后抵消了DPP-Ⅳ抑制剂所带来的抗应激性相关动脉粥样硬化作用。与S-Ana-C组相比，S-Ana-NAPN组动脉粥样硬化斑块新生内膜面积及内/中膜比例更大(198±11×103 vs392±23×103;0.9±0.1 vs1.7±0.1，P值均＜0.05)。　　四、GLP-1R激动剂促进了3T3-L1细胞APN的表达。　　体外实验发现，GLP-1激动剂以剂量依赖方式促进了3T3-L1脂肪细胞的APN表达。但DPP-Ⅳ抑制剂并不能直接刺激脂3T3-L1脂肪细胞的APN表达。　　结论:　　1.慢性应激促进了高脂饮食诱导的动脉粥样硬化的发展进程。同时伴有血浆中DPP-Ⅳ和GLP-1失衡，提示血DPP-Ⅳ和GLP-1水平的变化可能成为应激相关心血管疾病的一个新的生物学标记物。　　2.DPP-Ⅳ抑制剂能够在应激性动脉粥样硬化及血管老化中发挥有益作用，而这些作用能够被APN中和抗体减弱。提示DPP-Ⅳ抑制剂可能是通过改善GLP-1/GLP-1R-APN信号通路在应激性动脉粥样硬化发展过程中发挥生物学作用。　　3.DPP-Ⅳ可能成为治疗应激性生心血管疾病的一个新的靶点。

目录

声明

摘要

CONTENTS

Abbreviated control table

Chapter One Introduction

Chapter Two Materials and Methods

2．1．Animals

2．1．1．Groups

2．1．2．Mouse restraint stress protocols

2．1．3．Experimental Reagents

2．1．4．Laboratory Equipment

2．2．Sample collections

2．3．Levels of plasma and tissue DPP-Ⅳ activities

2．4．Histological sections

2．5．Quantitative real-time PCR

2．7．Oil red O staining

2．8．ELISA and biochemical analyses

2．9．Gelatin zymography

2．10．Western blot analysis

2．11．Senescence-associated β-galactosidase(β-Gal)staining

2．12．Flow cytometry analysis

2．13．Assay of NADPH oxidase-dependent superoxide production

2．14．Cell culture

2．15．Statistical analysis

Chapter Three Results

3．2．Stress aggravated the diet-induced vascular senescence and atherosclerotic plaque growth and component alteration

3．3．Stress enhanced inflammatory action，oxidative stress production and proteolytic enzyme expression and activity

3．4．Stress decreased the levels of plasma leptin，APN，and GLP-1 proteins and adipose APN gene

3．5．DPP-Ⅳ inhibition alleviated HF diet-induced vascular aging and atherosclerosis

3．6．Effect of anagliptin on inflammation and proteolytic enzyme expression and activity

3．7．DPP-Ⅳ inhibition increased the levels of plasma leptin，APN，and GLP-1 and the adipose APN expression in the stressed mice

Chapter Four Discussion

Chapter Five Conclusions

References

Supplementary Table

Supplementary Figure

Acknowledgements

Review

Appendix