红曲多糖高产菌株的诱变筛选及其提取纯化免疫活性研究

摘要

本论文旨在通过小白鼠试验给出红曲多糖的毒理特征和对提高机体免疫力的作用。并通过UV诱变红曲霉筛选红曲多糖的高产菌株，优化其液体发酵条件。研究了影响红曲多糖提取率和纯化程度的主要因素。通过一系列试验，初步给出了红曲多糖的理化性质、分子量、结构、以及组成成分等。 首先对红曲霉斜面培养基进行了研究，通过试验确定了麦芽汁糖化工艺，确定了斜面培养基：麦芽汁糖度6-8.5波美度，pH6-7，2％琼脂。 正常灌胃红曲多糖21天后，称量小鼠体重，并将肝、脾、肾、心、肺分别称重，计算脏体指数。结果可以看出，红曲多糖能增加肝脏质量，增加脾脏质量，而高浓度又降低脾质量，对其他各个器官无明显的不良影响。而且从SGPT含量来看，红曲多糖能显著降低其含量，而对血糖含量和SGOT含量影响不明显。结论是红曲多糖对小鼠无明显的毒害作用。 通过DTH试验，小鼠经灌胃红曲多糖后，其足跖肿胀度与对照组差异明显，说明红曲多糖能提高小鼠细胞免疫功能。在三氯甲烷致中毒试验中，和对照组相比，试验组SGPT含量有所降低说明红曲多糖有保肝护肝作用。碳粒廓清试验，给小鼠灌胃红曲多糖，能使廓清速率大幅增加表明红曲多糖可提高腹腔巨噬细胞吞噬能力，促使小鼠外周血E-玫瑰环形成，增加体内淋巴细胞转化率，使非特异性免疫加强。游泳试验和耐缺氧能力试验似乎说明红曲多糖在提高机体耐疲劳能力和缺氧条件下生活能力方面作用不大，有待进一步研究。 利用紫外线对出发菌株红曲霉AS3.4701进行诱变处理，经过初筛确定了最佳诱变剂量：254nm，2.0min。再经过复筛获得了一株最佳突变株ZH-100，该突变株经连续三次传代，结果红曲粗多糖的产量分别是4.26g/L，4.69g/L，4.10g/L，平均4.35g/L。证明该菌株具有稳定的遗传性，比出发菌株提高产量286％。 通过三组试验，包括：(1)发酵条件优化的正交试验；(2)无机元素的含量确定的平行试验；(3)优化的发酵条件验证试验。得出结论：红曲霉在经过斜面培养后，以大米浆为基础培养物(固形物10％)，加入NaNO30.15％，MgSO4·7H2O0.15％，KH2PO40.25％，温度35℃，220r/min摇床培养96小时，再经4000r/min离心5min，24小时醇沉，电热鼓风干燥等操作，产多糖量5.53g/L，高出初始条件27％。 通过正交试验优化得最佳提取条件为：浸提温度90℃；浸提料液比1：3；浸提时间30min。红曲多糖的产量为6.66g/L，高出初始条件20％。 利用苯酚-硫酸法测得红曲粗多糖中总糖含量为78％；利用3.5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量为12.5％；则多糖含量65.5％。利用考马斯亮蓝法测定可溶蛋白含量为5.2％。 通过试验确定了红曲粗多糖的纯化工艺，Sevag法除杂蛋白，透析带除盐及小分子物质，SephadexG-200柱层析，收集峰值的糖，冷冻干燥得红曲多糖纯品。 纸层析上只有一个海蓝色斑点，表明红曲多糖是单一纯物质。确定了展开剂为正丁醇-乙醇-水(12：3：5)。SephadexG-200柱层析呈单洗脱峰表明多糖组分均一。 通过一系列生化试验，红曲多糖粗品为浅红色粉末，纯品为白色粉末，较易溶于水，水溶液粘稠，pH6左右，无色无味，1％的红曲多糖水溶液粘度460mPa.s，与碘试剂不呈蓝色。苯酚-硫酸反应呈桔红色，蒽酮试剂反应呈蓝绿色，比旋光度[α]20D=1.66。不溶于高浓度乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。 本试验采用双向薄层层析方法，红曲多糖经2mol/L硫酸水解，展开剂氯仿：甲醇：水=16：9：2，对红曲多糖的组分进行了测定，基本确定了红曲多糖中含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖。 采用SephadexG-200进行凝胶过滤层析，上样量5mg/1m1，0.1mol/LNaCl溶液洗脱，利用已知分子量的葡聚糖做标准曲线，测定红曲多糖分子量为31.6万。 红外光谱IR分析：将2mg红曲多糖纯品与200mg纯KBr研细混合均匀在油压机上压成透明薄片，在TJ270-30红外分光光度计上IR分析，扫描范围4000-400cm-1，得出红曲多糖是β-吡喃型多糖。 通过该研究，证明了红曲多糖对生物有机体没有毒害作用，对提高机体免疫力有明显效果。通过结构和组成研究，证明了红曲多糖是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖，具有β-吡喃构型，进一步佐证了红曲多糖具有提高机体免疫力的作用。因而通过大量的诱变筛选得一株高产多糖的优势菌株，并优化了液体发酵条件，优化了提取条件，纯化条件。可以指导生产，并可以后续开发几种保健食品和饮料，以提高亚健康人群的免疫水平。

目录

文摘

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第一部分前言

1多糖的定义与结构

2真菌多糖的概述

3红曲多糖的概述

4本论文的研究目的和意义

第二部分研究内容

研究路线

1红曲多糖的毒理性及免疫性研究

1.1引言

1.2材料与方法

1.3结果与讨论

1.4毒理及免疫试验小结

2红曲多糖高产菌株的诱变筛选与培养基优化研究

2.1引言

2.2材料方法

2.3结果与讨论

2.4紫外诱变和发酵条件优化试验小结

3红曲多糖的提取、纯化及理化性质研究

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果与讨论

3.4提取纯化及理化性质研究小结

第三部分结论

1试验结果

2试验的不足和后续的研究方向

参考文献

致谢