冷季型香菇（Lentinula edodes）菌种的分子鉴定

摘要

本研究选用了32个应用广泛的冷季型香菇栽培品种和2个野生香菇菌种，应用ITS区序列差异比较、RAPD技术、ISSR分子标记和培养性状比较分析了它们之间的遗传相关性，结果表明： 1.通过对ITS区的序列分析表明，所有栽培香菇菌株序列同源性为98.49％，其中868、沪农3、秦19和香66，以及野11、庆科20、867和241-4之间有完全相同的序列。是否这些菌种是同物异名有待进一步证实。相反的，华939、939与L939有相似的名称，但ITS区序列存在5个碱基的差异。将所有栽培菌株的ITS区序列结合从GenBank中查寻的国外的野生菌株的ITS区序列进行系统分析，结果发现野生香菇菌株与栽培香菇菌株分属于两个分枝，说明栽培菌株与野生菌株间有遗传差异，栽培菌株间存在极大的遗传相似性，而且菌种间的遗传关系与地域没有联系。这进一步暗示32个栽培菌株的遗传多样性低。 2.从86个RAPD随机引物中筛选出9个引物对供试菌株的基因组DNA进行分析，共扩增出113条带，其中94条带具有多态性，多态性带的比率达83.19％。单个引物扩增的DNA片段的平均数目在13，片段的分子量大小在200～2500bp之间。如用引物A04扩增菌株868获得7条带，其片段大小在400～2300bp之间。综合分析9个具有多态性的DNA指纹图谱，被测试的34个香菇菌种之间均有遗传上的差异，能将所有菌株区分开来，从而证实了RAPD技术可以快速、灵敏、准确地用于食用菌菌种的检测和鉴定。从遗传相似系数及聚类结果表明，野生子实体与栽培品种之间存在明显的遗传差异；而多数栽培菌种聚在一起，遗传相似系数主要集中在0.50～0.70之间，说明香菇栽培菌种间的遗传背景十分单一。菌株华939、939和L939聚在一起，说明亲缘关系相近，可能是同物异名。 3.从100个ISSR引物中筛选出8个对供试菌株具有多态性的引物进行扩增，共产生98条DNA带，89.80％呈现多态性。如引物812扩增所有菌株共获得13条带。聚类分析结果显示，34个香菇菌株间均有遗传上的差异，但遗传相关性极高。同时表明ISSR扩增指纹能有效分辨不同菌株的基因型，为香菇栽培菌株的鉴定提供快速有效的技术手段和科学依据。菌株华939、939和L939聚在一起，说明亲缘关系相近，可能是同物异名。这与RAPD结果一致。 4.通过菌株栽培性状比较试验，发现32个菌株在菌丝生长速率、菌丝长势、菌落形态和出现原基的时间等方面有一定的差异。如平板试验中，菌株Cr20生长缓慢，而香26生长快。其中在平板试验和瓶栽试验中，菌丝生长速率趋于一致，即在平板试验中生长快的菌株，在瓶载试验中也生长快。这为实际生产应用中，该菌株是否能可作为生产菌种提供一个参考标准。但相同的菌株在不同的培养基中表现不同的生理性状，如菌株L26在平板培养基上生长较快，但是在木屑培养基中生长缓慢。 5.拮抗试验表明，供试的32个菌株间大多数都有明显的拮抗线产生，初步可推测它们之间在亲缘关系上有一定的距离。但有少数菌株间拮抗线不明显，如菌株867与香66。说明它们之间有很高的遗传相似性。

目录

文摘

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前言

第一章文献综述

1香菇概述

2香菇菌种鉴定研究现状

2.1形态学水平上鉴定

2.2分子生物学水平上鉴定

2.3其他方法

第二章香菇菌种的ITS分析

1试验材料

2试验方法

2.1试验所用试剂配制

2.2试验所需试剂

2.3基因组DNA提取

2.4 PCR扩增

2.5 PCR扩增产物的克隆

2.6 PCR克隆产物的序列测定

2.7 DNA序列分析

3结果与分析

3.1基因组DNA的提取

3.2 PCR反应的适宜条件

3.3 PCR扩增产物

3.4 PCR产物的克隆

3.5 DNA序列分析

4讨论

4.1基因组DNA的提取

4.2 DNA序列分析

第三章香菇菌种的RAPD分析

1试验材料

2试验方法

2.1基因组DNA提取

2.2 RAPD扩增

3结果与分析

3.1 RAPD条件的优化

3.2 RAPD扩增

4讨论

4.1 RAPD条件的优化

4.2 RAPD扩增

第四章香菇菌种的ISSR分子标记

1试验材料

2试验方法

2.1基因组DNA提取

2.2 ISSR扩增

3结果与分析

3.1 ISSR条件的优化

3.2 ISSR扩增

4讨论

4.1 ISSR条件的优化

4.2 ISSR扩增

第五章香菇菌种的形态学鉴定

1试验材料

2试验方法

2.1供试培养基

2.2菌丝的活化

2.3菌丝生长速率的测定

2.4拮抗试验

2.5栽培试验

3结果与分析

3.1菌丝生长速率

3.2拮抗试验

3.3栽培试验

4讨论

4.1菌丝生长速率

4.2拮抗试验

4.3出菇试验

第六章结论与讨论

参考文献

致谢