胰岛素对3T3-L1脂肪细胞HDL生成相关功能蛋白ABCA1的影响及机制研究

摘要

背景与目的：动脉粥样硬化性心血管疾病是导致人类死亡的首要原因。而血脂异常是其最主要的危险因素之一。尽管他汀类药物的有效使用，甚至是剂量的加倍，且当 LDL-C降至70mg/dL以下时，心血管剩余风险仍然存在。因此，为了更进一步降低心血管剩余风险，人们逐渐又开始了对其他影响心血管疾病风险因素的探索，如HDL-C。高胰岛素血症/胰岛素抵抗是动脉粥样硬化性心血管疾病的主要危险因素。HDL水平的降低常是高胰岛素血症最主要血脂谱改变之一，但其具体机制仍不明确。本研究以3T3-L1脂肪细胞为研究对象，旨在讨论高胰岛素环境对HDL生成相关功能蛋白ABCA1的影响，并且探索其具体信号通路机制，为心血管剩余风险的干预提供新的基础医学证据。
　　方法：本实验以3T3-L1前脂肪细胞为研究对象，通过“鸡尾酒法”诱导分化为成熟的脂肪细胞；予以不同浓度的胰岛素（0 nmol/L、10 nmol/L、102nmol/L、103nmol/L）刺激，利用葡萄糖氧化酶法（GOD）检测细胞培养基剩余葡萄糖含量以确定是否成功建立胰岛素抵抗模型；利用液体闪烁计数技术检测细胞3H标记胆固醇流出；采用SYBR Green I嵌合荧光法通过实时荧光定量技术检测不同浓度的胰岛素对3T3-L1成熟脂肪细胞ABCA1 mRNA表达的影响；利用Western blot技术检测胰岛素对3T3-L1成熟脂肪细胞ABCA1蛋白表达的影响及相关机制研究。
　　结果：1.与对照组相比，胰岛素浓度为103 nmol/L条件下，细胞培养基上清剩余葡萄糖增多（P<0.01），提示胰岛素抵抗模型建立。
　　2.胰岛素能呈浓度和时间依赖性抑制3T3-L1脂肪细胞胆固醇的流出（P<0.05）。
　　3.不同浓度的胰岛素对ABCA1 mRNA的调控无影响（P>0.05）。
　　4.胰岛素能呈浓度和时间依赖性下调ABCA1蛋白的表达（P<0.05）。
　　5.胰岛素是通过calpain或proteasome途径促进ABCA1蛋白降解。
　　6.胰岛素能呈浓度依赖性促进胰岛素受体磷酸化，而PI3K/Akt信号通路选择性抑制剂LY294002能抑制胰岛素对ABCA1蛋白的降解的促进作用（P<0.01），MAPK信号通路选择性抑制剂Raf inhib I却不能（P>0.05）。
　　结论：胰岛素可通过IRS/PI3K/Akt信号通路促进ABCA1蛋白的降解以及下调ABCA1介导的胆固醇流出，从而不利于脂肪细胞HDL的生成。

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课题资助

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缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

主要实验材料和试剂配置方法

一、主要实验试剂

二、主要实验仪器

三、主要试剂的配置方法

主要实验技术与方法

一、小鼠3T3-L1前脂肪细胞的培养及诱导分化

二、油红O染色

三、葡萄糖氧化酶（GOD）法葡萄糖消耗测定

四、3H标记胆固醇流出实验测定

五、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）检测ABCA1 mRNA表达

六、蛋白印迹法（Western blot）检测ABCA1蛋白表达

七、统计学处理

实验结果

一、3T3-L1前脂肪细胞经诱导分化后为成熟的脂肪细胞

二、胰岛素抵抗模型的建立

三、胰岛素呈浓度和时间依赖性抑制3T3-L1脂肪细胞胆固醇流出

四、不同浓度的胰岛素对ABCA1 mRNA表达均无明显影响

五、胰岛素呈浓度和时间依赖性抑制ABCA1蛋白水平的表达

六、胰岛素可通过calpain和proteasome途径促进ABCA1蛋白的降解

七、胰岛素是通过IRS/PI3K/Akt信号通路介导ABCA1蛋白的降解

讨论

结论

参考文献

文献综述

硕士期间研究成果

致谢