鞘内注射Reelin基因干扰慢病毒载体对大鼠慢性神经病理性疼痛的研究

摘要

目的：探讨鞘内注射 Reelin基因干扰慢病毒载体(LV-Reelin-RNAi)对慢性坐骨神经压迫性损伤（chronic constriction injury，CCI）疼痛大鼠脊髓水平 Reelin的表达变化及疼痛行为学的影响。
　　方法：鞘内置管成功后无运动障碍的SD雄性大鼠144只，体重200-270g，随机分为4组：Sham组(n=36)，CCI组(n=36)，RNAi组(n=36)和空载体组(n=36)。Sham组大鼠只暴露右侧坐骨神经后不结扎，而其他三组大鼠在暴露右侧坐骨神经后，用4.0含铬羊肠线轻轻的结扎四道以制造慢性坐骨神经压迫性损伤疼痛模型。术后第1天，各组分别鞘内注射生理盐水15μl、生理盐水15μl、LV-Reelin-RNAi5μl+生理盐水10μl、空载体5μl+生理盐水10μl。各组大鼠均于术前1d、术后1d、4d、7d、10d、14d和21d测量双侧后足底机械缩足阈值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）和热缩足潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）。各组在第7、14、21天取腰膨大，采用QPCR、Western blot和石蜡切片免疫组化（Immunohistochemistry-paraffin sections，IHC-P）检测脊髓背角Reelin mRNA和蛋白的表达。
　　结果：术前各组大鼠PWMT和PWTL无显著性差异；CCI模型大鼠手术测术后各组各时间点PWMT和PWTL均明显降低（P<0.05）,手术侧脊髓背角Reelin mRNA的表达量和Reelin 蛋白表达量CCI术后明显减少（P<0.05）。鞘内注射LV-Reelin-RNAi可进一步降低 PWMT和PWTL。与之相对应，大鼠右侧脊髓背角Reelin mRNA和蛋白的表达也进一步降低（P<0.05）。鞘内注射空载体对慢性神经病理性疼痛大鼠的疼痛行为学、Reelin mRNA和Reelin蛋白表达无明显影响（P>0.05）。
　　结论：脊髓水平Reelin的表达在慢性压迫坐骨神经诱发慢性神经病理性疼痛后明显下降；鞘内注射LV-Reelin-RNAi可进一步下调Reelin在脊髓背角的表达并且加剧神经病理性疼痛症状。Reelin可能参与慢性压迫性神经病理性疼痛的产生与发展。

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主要英文缩略索引

第1章 前言

第2章 Reelin基因干扰慢病毒（LV-Reelin-RNAi）构建

1.实验试剂

2.构建流程

2.1 siRNA设计

2.2合成oligo信息

2.3目的慢病毒载体

2.4 载体酶切反应体系

2.5阳性克隆的 PCR 鉴定

2.6 重组克隆制备

2.7 慢病毒包装

2.8病毒的收集与浓缩

2.9慢病毒滴度测定

第3章 材料与方法

1.材料

1.1.试剂

1.2.仪器

2.方法

2.1 实验动物

2.2 鞘内置管

2.3 实验分组

2.4 CCI模型的制备

2.5 导管注射慢病毒

2.6 疼痛行为学测试

2.7实时荧光定量PCR法检测Reelin mRNA的表达

2.8蛋白免疫印迹杂交法（Western Blot）

2.9 石蜡切片免疫组化（immunocytochemistry,IHC-P)

3.0 统计学处理

第4章 结果

1.大鼠行为学改变和痛阈值变化

1.1一般行为学观察

1.2 鞘内注射LV-Reelin-RNAi进一步降低PWMT

1.3鞘内注射LV-Reelin-RNAi进一步降低PWTL

2.鞘内注射LV-Reelin-RNAi下调脊髓背角Reelin mRNA表达

3.鞘内注射LV-Reelin-RNAi下调脊髓背角Reelin表达

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

文献综述:Reelin相关机制的研究进展

已发表的文章

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