亚精胺通过上调GDF11拮抗高糖诱导HT22细胞内质网应激

摘要

目的： 高糖(High glucose,HG)诱导神经细胞内质网应激在糖尿病脑病(Diabetic encephalopathy,DE)中具有重要的作用。亚精胺(Spermidine,Spd)作为一种天然多胺，具有抗内质网应激作用。那么，Spd是否可拮抗HG诱导神经细胞内质网应激？ 生长分化因子11(Growth differentiation factor11,GDF11)具有神经保护作用。如果Spd能拮抗HG诱导的神经细胞内质网应激，GDF11是否介导该作用？ 为此，本研究将在小鼠海马神经元HT22细胞上明确Spd对HG诱导神经细胞内质网应激的拮抗作用，阐明GDF11对这一作用的介导效应。 方法： 1.Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测HT22细胞存活率； 2.蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测HT22细胞中GDF11蛋白及内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白(Glucose-regulated protein78,GRP78)和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,Cleaved caspase-12)的表达； 3.GDF11shRNA转染HT22细胞沉默GDF11的表达； 4.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染GDF11shRNA后HT22细胞中GDF11mRNA的表达。 结果： 1.HG诱导HT2细胞内质网应激 1.1.HG(13.5,27,40.5mg/ml,24h)处理HT22细胞能显著降低HT22细胞活力，表明HG对HT22细胞具有细胞毒性作用。 1.2.HG(13.5,27,40.5mg/ml,24h)处理HT22细胞能明显上调HT22细胞中内质网应激相关蛋白GRP78和Cleaved caspase-12的表达，表明HG可诱导HT22细胞产生内质网应激。 2.Spd拮抗HG诱导的HT22细胞内质网应激 2.1.Spd(0.25,0.5,1μM,30min)预处理HT22细胞能有效抑制HG诱导的HT22细胞活力下降，表明Spd具有拮抗HG神经细胞毒性的作用。 2.2.Spd(0.25,0.5,1μM,30min)预处理HT22细胞可抑制HG(27mg/ml,24h)诱导的HT22细胞内质网应激相关蛋白GRP78和Cleaved caspase-12的表达增加，表明Spd可拮抗HG诱导HT22细胞内质网应激。 3.GDF11介导Spd对HG诱导的HT22细胞内质网应激的拮抗作用 3.1.HG(13.5,27,40.5mg/ml,24h)处理可浓度依赖性地抑制HT22细胞中GDF11蛋白的表达，提示GDF11蛋白的下调可能与HG诱导HT22细胞内质网应激有关。 3.2.Spd(0.25,0.5,1μM,30min)预处理可逆转HG对HT22细胞GDF11蛋白的下调作用，且单独使用Spd(1μM)可明显上调HT22细胞中GDF11的表达，提示GDF11蛋白的上调可能与Spd拮抗HG诱导HT22细胞内质网应激有关。 3.3.GDF11shRNA能取消Spd对HG诱导HT22细胞毒性及内质网应激的拮抗作用，表明抑制GDF11表达可逆转Spd拮抗HG诱导的HT22细胞内质网应激。 结论： Spd通过上调GDF11的表达拮抗HG诱导的HT22细胞内质网应激。

目录

声明

缩略词

第1章 绪 论

1.1 HG与神经细胞内质网应激

1.2 亚精胺与内质网应激

1.3 GDF11与神经保护作用

1.4 本课题的科学假说和研究思路

第2章 材料与方法

2.1.1 仪器设备

2.1.2 主要试剂

2.2 药品和试剂的配制

2.2.1PBS平衡盐溶液配制

2.2.2HG (49.5 mg/ml)母液配制

2.2.3Spd (1 mM)母液配制

2.3.1 细胞培养

2.3.2 细胞加药处理方法

2.3.3细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)法检测细胞活力

2.3.4Westernblotting检测HT22细胞中GRP78、Cleaved caspase-12、GDF11蛋白的表达

2.3.5 GDF11 shRNA (shGDF11)转染实验

2.3.4Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)检测细胞中GDF11 mRNA表达

2.3.5 统计学分析

第3章 结果

3.1 HG可诱导HT22细胞内质网应激

3.1.1 HG可降低HT22细胞活力

3.1.2 HG可诱导HT22细胞内质网应激

3.2 Spd可拮抗HT22细胞中HG诱导的内质网应激

3.2.1 Spd可拮抗HG诱导的HT22细胞活力下降

3.2.2 Spd可拮抗HG诱导的HT22细胞内质网应激

3.3 Spd可拮抗HG对HT22细胞GDF11的下调作用

3.3.1 HG可抑制HT22细胞GDF11蛋白的表达

3.3.2 Spd可上调HG处理的HT22细胞GDF11表达

3.4 GDF11 shRNA (shGDF11)可逆转Spd对HG诱导的HT22细胞毒性的拮抗作用

3.4.1 shGDF11可逆转Spd对HG抑制HT22细胞活力的拮抗作用

3.4.2 shGDF11可逆转Spd对HG诱导HT22细胞内质网应激的拮抗作用

第4章 讨论

4.1 HG可诱导HT22细胞内质网应激

4.2 Spd可拮抗HG诱导HT22细胞内质网应激

4.3 GDF11介导Spd对HG诱导HT22细胞内质网应激的拮抗作用

第5章 结论

参考文献

文献综述:亚精胺在神经系统的调节和保护功能

攻读硕士期间发表文章

致谢