过氧化物酶体增殖物激活受体D基因甲基化在肺腺癌发展中作用研究

摘要

目的： 肺癌已成为目前全球范围内最常见和发病率最高的恶性肿瘤。在中国，肺癌已经跃居男性癌症的首位，女性中也有突破乳腺癌跃居首位的趋势。肺癌按组织病理学分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，非小细胞肺癌发病率占全部肺癌的80%，其中肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见的组织亚型。本研究拟通过表观遗传学技术筛选肺腺癌DNA甲基化生物标志物。进一步探索过氧化物酶体增殖物激活受体D（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARD）在肺腺癌演变过程中的表观遗传调控机制及其关键作用，为肺腺癌的诊断和治疗提供科学依据和理论基础。 方法： 1.利用Illumina850k DNA甲基化芯片筛选正常肺上皮细胞与肺腺癌细胞间差异的DNA异常甲基化修饰；运用DAVID Bioinformatics Resources6.8(https://david.ncifcrf.gov/)进一步分析相关基因的生物学功能。通过TCGA数据库，分析PPARD基因表达数据和患者临床病理信息，大样本验证PPARD基因表达与患者预后的相关性。 2.应用甲基化特异性PCR（MSP）、实时荧光定量PCR（qPCR）、Western blot方法验证肺腺癌组织及癌旁组织（n=12）中PPARD启动子区DNA差异甲基化和PPARD表达变化。 3.构建PPARD低表达细胞株（NCI-H1975和NCI-H1395），通过CCK8、transwell和细胞划痕实验观察PPARD基因在肺腺癌细胞增殖、侵袭和迁移中的作用。 结果： 1.通过Illumina850k DNA甲基化芯片的分析，共筛选出差异甲基化位点2414个，相关基因1676个。与正常肺细胞比较，肺腺癌细胞中PPARD基因启动子关键位点存在异常甲基化改变。同时，TCGA数据库表达分析示，与对照相比较，肺腺癌中PPARD基因呈高表达，且与临床分期、性别等因素无相关性。 2.肺腺癌组织中PPARD甲基化率明显低于癌旁组织（P＜0.05）。qPCR和Western blot结果示，肺腺癌组织中PPARDmRNA水平和蛋白质水平均高于癌旁组织（1.44±0.46，P＜0.05；2.04±1.61，P＜0.05）。 3.通过在体外培养肺腺癌细胞中干扰PPARD表达，发现可以一定程度抑制NCI-H1975和NCI-H1395细胞株的迁移和细胞生存能力，但对细胞的侵袭能力无影响。 结论： 肺腺癌中PPARD启动子区关键位点可能在其表观遗传调控过程中起到重要作用。PPARD可促进肺腺癌细胞的增殖并帮助肺腺癌细胞转移。因此，综上所述，PPARD是一种潜在的肺癌治疗的药物靶标。

目录

声明

第1章 绪 论

1.1 研究目的及意义

1.2 研究内容

1.2.1 肺癌细胞和正常肺上皮细胞中差异甲基化基因分析

1.2.3 过氧化物酶体增殖物激活受体D（PPARD）表达改变对肺腺癌细胞生物学功能的影响

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器

2.1.3 常用试剂配制

2.1.4 细胞株

2.1.5 组织标本

2.2 研究方法

2.2.1 细胞培养和细胞转染

2.2.2 提取DNA

2.2.3 总RNA提取

2.2.4Illumina Infinium HumanMethylation850 BeadChip操作方法

2.2.5TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据分析

2.2.6 DNA的亚硫酸盐修饰

2.2.7MSP（methylation specic PCR）反应

2.2.8 qPCR 反应

2.2.9Western Blot

2.2.10 细胞划痕实验

2.2.11 细胞增殖实验

2.2.12 肿瘤细胞体外侵袭实验

第3章 统 计 分 析

第4章 结 果 分 析

4.1Illumina 850k DNA甲基化芯片数据分析

4.1.1 样本β值密度曲线

4.1.2 差异甲基化位点

4.1.3 信号通路分析

4.2应用TCGA数据库大样本分析PPARD表达和生存率的关系

4.3 肺腺癌组织及癌旁组织中PPARD甲基化及表达水平

4.3.1 肺腺癌组织及癌旁组织中PPARD甲基化水平

4.3.2 肺腺癌组织及癌旁组织中PPARD表达水平

4.4 PPARD低表达对肺腺癌细胞生物学功能的影响

4.4.1 构建PPARD低表达细胞株

4.4.2 PPARD在肺腺癌细胞增殖中的作用

4.4.3 PPARD在肺腺癌细胞侵袭中的作用

4.4.4 PPARD在肺腺癌细胞迁移中的作用

第5章 讨 论

第6章 结 论

综述:过氧化物酶体增殖物激活受体D在肺癌中的研究进展

参考文献

作者攻读学位期间的科研成果

致谢