RUNX3基因甲基化修饰及其下游AKT信号通路在人肺腺癌化疗耐药表型中的作用研究

摘要

肺癌目前是世界上最常见的恶性肿瘤，严重危害人类健康。近年来，肺癌的发病率和死亡率呈急剧上升的态势。在北美，肺癌的5年生存率仅为15％，我国则更低。肺癌通常分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，在NSCLC中，肺腺癌发病率上升明显，在许多国家已超过鳞状细胞癌成为最常见的肺癌组织类型。肺癌起病非常隐匿，约3/4的患者在初诊的时候就已经发生了晚期转移，手术的机会受到了很大的限制，因此化疗仍然是肺癌临床治疗的重要手段之一。虽然在过去的二十余年对肺癌的生物遗传学行为的研究有了很大的进展，但至今仍然没有很有效的方法可以治愈肺癌。化疗耐药的存在仍然制约着肺癌治疗取得进一步效果。大多数患者的死因与耐药之间存在着直接或者间接的关系，如何逆转肿瘤细胞的耐药性将是提高肿瘤化疗效果的关键。随着第三代化疗药物的应用，NSCLC的化学治疗有了很大进步。多西紫杉醇(docetaxel，多西他赛)是第三代化疗药物中的代表药物之一，它的前体是从欧洲紫杉针叶中提取，经半合成而获得，其作用机理主要是促进细胞内微管双聚体聚合，从而形成稳定的微管聚合物，抑制其解聚，使游离的微管数量显著减少，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂和增殖，导致肿瘤细胞死亡，具有较高的抗肿瘤活性。但与其他化疗药物一样，耐药现象的存在限制了其有效应用。然而，有关多西他赛的耐药机制，国内外研究尚不充分。本课题组前期首先通过逐渐增加药物浓度在体外诱导筛选出对多西他赛耐药的肺腺癌细胞株(SPC-A1/DTX，H1299/DTX)，并观察了耐药细胞与亲本细胞(SPC-A1，H1299)之间的生物学特性差异。随后，通过cDNA表达芯片与甲基化芯片的分析，我们最终筛选出RUNX3与多西他赛化疗药物敏感性相关，并进行深入的研究。体外功能实验表明，SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中RUNX3过表达可抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、诱导细胞G1期阻滞并增加多西他赛化疗敏感性;而SPC-A1和H1299细胞中抑制RUNX3表达则起到相反效果。通过建立移植瘤动物模型，腹腔注射多西他赛，来观测肿瘤的生长，结果进一步表明瘤内稳定高表达RUNX3可以明显增强多西他赛的化疗敏感性。通过定制的Realtime-PCR芯片，我们发现以上结果可能的机制为RUNX3能够抑制AKT信号通路的激活，并经共转染Akt1持续活化质粒实验验证。临床标本中的结果也表明，肺腺癌组织RUNX3表达与Akt1呈负相关，且RUNX3高表达提示患者采用含多西他赛辅助化疗方案的无病生存期(DFS)较短。总之，高甲基化诱导的RUNX3下调可能通过对AKT信号通路的活化参与肺腺癌多西他赛耐药机制，RUNX3基因可望成为肺腺癌多西他赛化疗敏感性的预测指标及逆转耐药的潜在靶点。　　 第一部分人肺腺癌耐多西他赛细胞株与亲本细胞株的cDNA表达与甲基化芯片差异　　 目的:探讨肺腺癌耐药细胞系(SPC-A1/DTX)与亲本细胞系(SPC-A1)中基因表达差异与启动子甲基化差异谱。　　 方法:借助上海伯豪生物技术有限公司Affymetrix cDNA芯片服务平台对SPC-A1/docetaxel和亲本SPC-A1细胞进行cDNA差异表达谱进行筛选（重复三次），经过滤条件筛选到的数据进行SAM分析，筛选出cDNA差异表达谱，并通过Realtime-PCR进行验证。同时依托台湾华联生物科技有限公司(PhalanxBiotech Group)高通量DNA甲基化芯片筛选平台技术对SPC-A1/docetaxel和亲本SPC-A1细胞进行DNA甲基化差异谱进行筛选（重复三次），经过滤条件筛选到的数据进行SAM分析，筛选出DNA甲基化差异表达谱，并通过MSP进行验证。　　 结果:耐药细胞系(SPC-A1/DTX)中，从cDNA表达芯片数据中筛选出基因表达下降最明显的有:SERPINB5（60.9倍），LUM（57.3倍），ING4（39.4倍），CYP1A1(33.8倍),RASIP1(24.5倍),SFRP1(24.15),RNASEK(22.1倍),TMPRSS11F(20.4倍)，GALR2（18.7倍），KRT15（18.5倍），RUNX3（17.8倍），ABCG2（17.1倍），ABCC3（16.5倍）。甲基化芯片数据显示甲基化发生率(△_beta＞0.8)的有FOXO1A(0.952),ADAM33(0.915), CEBPA(0.897), SFRP1(0.882),FLNC(0.873), DAPK1(0.862), SNX9(0.842), MATN2(0.831), NAP1L5(0.819), STAP2(0.816), ADAM12(0.807), HOXD11(0.806), F2R(0.804),TAPBPL(0.803)，MMP14(0.802)，RUNX3(0.801)。最终发现两个芯片有一个共同基因:RUNX3。MSP和Realtime-PCR芯片证实RUNX3基因在 SPC-A1/DTX中发生高甲基化且表达明显下调。　　 结论:启动子甲基化诱导的RUNX3基因表达下调很有可能参与了肺腺癌细胞SPC-A1/DTX的多西他赛耐药，有望为肺腺癌多西他赛化疗提供有价值的分子标记物，并为逆转其耐药表型提供潜在的分子治疗靶点。　　 　　 第二部分 RUNX3在肺腺癌中的体内与体外的功能分析　　 目的:利用体内、外模型，从细胞增殖、凋亡和细胞周期等方面验证RUNX3参与调节人肺腺癌细胞多西他赛化疗敏感性。　　 方法:通过MTT法和Realtime-PCR检测不同浓度5-Aza-dc处理48小时后SPC/DTX、H1299/DTX细胞对多西他赛的IC50及RUNX3的基因表达改变;通过合成RUNX3基因表达载体(N-eGFP-RUNX3)和RNA干涉载体(pGPU-shRUNX3)并分别转染人肺腺癌SPC-A1/DTX、H1299/DTX，SPC-A1、H1299细胞，人为改变细胞内RUNX3表达水平，MTT法测定细胞对多西他赛敏感性差异;克隆形成实验测定细胞体外增殖能力差异;流式细胞术检测细胞周期及凋亡率差异。将SPC-A1/DTX分别转染空质粒对照(NC-eGFP)和(RUNX3-eGFP)后建立裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤后定时给予多西他赛腹腔注射并绘制肿瘤生长曲线，适时处死动物后取瘤体组织，免疫组化染色检测RUNX3、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）阳性率差异。　　 结果:10μM5-Aza-dc处理SPC/DTX、H1299/DTX细胞后，其对于多西他赛的IC50值显著下降，RUNX3未甲基化比例明显升高，RUNX3表达明显升高。在SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中人为上调RUNX3表达水平后，细胞对多西他赛敏感性显著提高(P＜0.01)，细胞体外增殖能力下降(P＜0.01)，细胞早期凋亡率增加(P＜0.01)，细胞周期G1期显著阻滞（P＜0.01）及G2/M期减少(P＜0.01);相反，在SPC-A1和H1299细胞中人为下调RUNX3表达水平后，细胞对多西他赛敏感性显著降低(P＜0.05)，SPC-A1细胞体外增殖能力下降(P＜0.05)，细胞周期G1期减少(P＜0.05)并出现G2/M期增加(P＜0.05)。在裸鼠移植瘤模型中，人为上调RUNX3表达水平并给予多西他赛化疗可协同抑制SPC-A1/DTX细胞的成瘤能力，显著增加肿瘤细胞对多西他赛治疗的反应性，并诱导瘤体组织内PCNA表达降低，提示细胞增殖能力受阻。　　 结论:小剂量5-Aza-dc可能通过去除RUNX3启动子甲基化状态，上调RUNX3基因表达而部分逆转SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞对多西他赛的化疗耐药。RUNX3可在体内、外对肺腺癌细胞产生显著的多西他赛化疗增敏作用，同时伴有细胞增殖受阻、凋亡增加，以及细胞周期分布的明显变化。　　 　　 第三部分RUNX3对下游AKT信号通路的作用　　 目的:进一步探讨RUNX3参与调节人肺腺癌细胞多西他赛化疗敏感性的可能机制。　　 方法:将RUNX3基因表达载体(NC-eGFP)和（RUNX3-eGFP）分别转染人肺腺癌耐药细胞系(SPC-A1/DTX)，使用常州楚天生物有限公司定制肿瘤表达谱PCR芯片应用实时荧光PCR同时对肿瘤信号通路相关的88个基因进行表达分析。芯片包含了与细胞周期，细胞凋亡，DNA修复，血管的形成以及肿瘤细胞转移的相关一系列基因。发现Akt/GS3Kβ/β-catenin信号通路为RUNX3下游多西他赛耐药主要相关信号通路。通过RUNX3基因过表达载体（RUNX3-eGFP）与持续活化AKT质粒共转染SPC-A1/DTX细胞，人为逆转RUNX3过表达对耐药细胞株的影响，Western blot检测Akt/GS3Kβ/β-catenin下游末端靶分子的蛋白表达。对人类肺腺癌亲本细胞株(SPC-A1)使用AKT抑制剂（MK-2206），MTT法测定细胞对多西他赛敏感性差异;克隆形成实验测定细胞体外增殖能力差异;流式细胞术检测细胞周期及凋亡率差异。选取39例使用过包含多西他赛化疗方案的肺腺癌术后肿瘤组织样本，通过免疫组化检测组织中RUNX3和AKT表达情况，采用Kaplan-Meier生存曲线分析患者生存。　　 结果:在人肺腺癌耐药细胞系(SPC-A1/DTX)中过表达RUNX3后，Akt1，p-AKT,p-GSK3β，β-catenin，CyclinD1，bcl-2，bcl-xl蛋白表达显著下降，而p21，Bax则显著上升，而共转染持续活化Akt质粒则可逆转RUNX3过表达引起的上述改变。在人类肺腺癌亲本细胞系(SPC-A1)中通过抑制AKT信号通路，显著增加细胞对多西他赛的敏感性(p＜0.01)，抑制细胞增殖能力(p＜0.05)，有效阻滞G1期(p＜0.01)并减少G2/M期(p＜0.01)，但细胞早期凋亡率无明显变化(p＞0.05)。在肺腺癌临床组织样本中，RUNX3的表达水平与Akt1的表达（Spearman，rho=-0.607，p＜0.01）存在负相关，且RUNX3高表达提示患者无病生存期(Disease Free Survival, DFS)不佳(P＜0.05)。　　 结论:RUNX3可以显著抑制Akt1的表达和Akt/GS3Kβ/β-catenin信号通路活化，在人肺腺癌亲本细胞系(SPC-A1)中抑制Akt/GS3Kβ/β-catenin信号通路后可以模拟RUNX3过表达对于人肺腺癌耐药细胞系(SPC-A1/DTX)的作用，提示RUXN3的表达下降是通过Akt/GS3Kβ/β-catenin信号通路的活化从而导致人类肺腺癌多西他赛化疗耐药。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

前言

参考文献

第一部分 人肺腺癌耐多西他赛细胞株与亲本细胞株的mRNA表达与甲基化芯片差异

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第二部分 RUNX3在肺腺癌中的表达及功能分析

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第三部分 RUNX3对与下游AKT信号通路的作用

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

结论与展望

文献综述

发表论文

致谢