表达狂犬病病毒糖蛋白的伪狂犬病病毒gG基因缺失转移载体的构建

摘要

狂犬病是重要的人兽共患传染病，能引起中枢神经系统的感染，致死率几乎100％。近年来狂犬病在中国的发生呈逐年上升的趋势，我国人狂犬病病例攀居世界第二。家养犬是我国狂犬病的重要传播宿主，85％-95％的人狂犬病病例是由犬咬伤所导致，50％-70％的狂犬病病例发生在农村。目前我国国内的疫苗免疫效果不佳，动物的总体免疫覆盖率偏低，而其是根本原因之一，是缺少安全有效、价格低廉、使用方便的动物狂犬病疫苗。因此研制安全有效的兽用狂犬病疫苗，是从根本上控制人狂犬病的关键。犬及犬鼬科野生动物是狂犬病病毒侵入人群的主要传播媒介。因此研制安全有效的动物用狂犬病疫苗，是预防人狂犬病的关键。本实验室工作中，建立了以伪狂犬病病毒为载体表达狂犬病病毒糖蛋白SRV9的转移载体。 伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus PRV)引起的家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒、呼吸和神经系统疾病为特征的急性传染病，妊娠母猪可发生死胎和流产，是危害养猪业的一个重要传染病。PRV作为一种疱疹病毒，拥有庞大的基因组和许多非必需区，具有用作表达外源基因的巨大潜力，被认为是理想的活疫苗载体。PRV的蛋白激酶(PK)基因是PRV体外生长和复制的非必需基因，却是病毒神经毒力的必需成分。通过诱变或基因工程技术使PK基因灭活后，病毒的毒力显著降低，但其免疫原性没有改变，因此PK基因是外源基因的理想插入区之一。 该试验构建了并列表达绿色荧光蛋白和狂犬病糖蛋白表达框的重组病毒载体。以研究重组病毒诱导动物机体产生狂犬病中和抗体的水平，并为伪狂犬病病毒载体的容量研究提供理论依据。 本试验以伪狂犬病毒TK/gI缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA，用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7kb片段，将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA，克隆含gG基因的EcoRV/StuI片断，用限制性内切酶BamHI和NdeI缺失gG基因，构成重组质粒pIRV，同时，分别将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo，构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒，将表达盒插入到pIRV，为构建gG基因缺失转移载体。此转移载体为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。 构建出可以用于同源重组的转移载体pIRV-SR，然后将PRV TK/gI缺失疫苗株基因组DNA与转移载体pIRV-SR DNA共转染PK-15细胞，出现病变后经蚀斑克隆纯化在荧光显微镜下可观察到绿色荧光。上述结果说明质粒pIRV-SR(正)，pIRV-SR(反)作为转移载体是可行的。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

前言

第一篇文献综述

第一章疱疹病毒载体的研究进展

第二章狂犬病病毒糖蛋白及基因工程疫苗相关研究

第二篇研究内容

第一章伪狂犬病病毒gG-基因缺失转移载体的改造

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

第二章伪狂犬病毒gG-基因缺失转移载体的表达调控研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

5小结

结 论

参考文献

致谢

作者简历