L-肉碱对洛氏鱥幼鱼氧化应激的保护作用及其机理研究

摘要

鱼类因其独特的生理状况以及复杂多变的水域环境;极易产生氧化应激。为弥补应激问题对水产养殖业造成的损失;研究者们纷纷将视线转移到营养型抗氧化剂开发上。其中;L-肉碱（L-Carnitine）因其独特的生理功能;在人类疾病治疗方面发挥重要作用;尤其在氧化应激相关的疾病方面已开展深入研究。但对鱼类的研究还很浅显;L-肉碱作为抗氧化剂在水产领域应用尚未普及;有关抗氧化功能的报道亦较少;其抗氧化机制也尚未明确。因此;本研究首先以胖头鱥肌肉细胞系（fathead minnow muscle cell line;FHM）为对象;克隆Nrf2基因序列进行生物信息学分析;设计siRNA;构建Nrf2基因沉默FHM细胞;以常用化学诱导剂H2O2作为氧化应激诱导因子;探讨L-肉碱对氧化应激状态下正常FHM细胞及siRNA Nrf2沉默FHM细胞抗氧化功能的影响;在体外条件下对其机理进行初步的探索。同时采用吉林省地方名优土著鱼类-洛氏鱥(Rhynchocypris lagowski Dybowski)为研究对象;以氧化鱼油作为氧化应激诱导因子;在活体水平建立氧化应激鱼体模型;进而研究 L-肉碱对洛氏鱥抗氧化功能的影响;为 L-肉碱抗氧化作用机理的揭示和 L-肉碱作为安全有效的抗氧化剂应用于实际生产奠定理论基础。 本研究共包括四部分试验;结果及结论如下： (1) FHM Nrf2基因克隆及其生物信息学分析 从FHM细胞中克隆出Nrf2基因序列：全长2578 bp;其中包括124 bp 5’-非翻译区;684 bp 3’-非翻译区;1770 bp开放阅读框(ORF);编码588个氨基酸;无信号肽;蛋白质理论分子量和等电点分别为66.3 KDa和4.47。SMART 和CDD预测显示该蛋白含有一个 BZIP 结构域;与鲤鱼、稀有鮈鲫、斑马鱼和草鱼同源性达70%以上;与鲤鱼亲缘关系最近。 (2) L-肉碱激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路缓解FHM细胞氧化应激 为验证L-肉碱激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路缓解FHM细胞氧化应激;首先根据FHM细胞Nrf2基因序列;设计Nrf2 siRNA;根据mRNA表达水平筛选出沉默效果较好的一对siRNA-242;用于后续试验。通过对正常及Nrf2 siRNA 沉默FHM细胞进行H2O2处理以及L-肉碱预保护处理;研究L-肉碱对氧化应激正常及Nrf2 siRNA 沉默FHM细胞抗氧化功能的影响。采用流式技术对细胞周期及细胞凋亡进行了检测;结果表明：H2O2 会通过阻滞FHM细胞周期停滞于 G1期;显著降低细胞增殖(P<0.05);增加坏死细胞数量;促进细胞凋亡(P<0.05)。通过对这两种细胞中脂质过氧化 MDA 水平及抗氧化相关指标（T-AOC 水平、T-SOD活性、CAT活性、GSH含量及GSH-PX活性）的检测进一步说明了H2O2刺激显著降低了细胞的抗氧化能力(P <0.05);但L-肉碱可通过下调Keap1基因表达水平;上调Nrf2、Maf和HO-1基因mRNA相对表达水平来抵抗H2O2 刺激对细胞造成的氧化应激(P <0.05);抑制细胞坏死(P <0.05);促进细胞增殖(P<0.05);同时下调MDA水平(P <0.05);提高机体抗氧化功能(P <0.05)。但Nrf2 siRNA处理导致L-肉碱对H2O2 刺激FHM细胞的保护作用削弱;对细胞抗氧化能力提高的作用下降。 (3)氧化鱼油诱导洛氏鱥幼鱼构建鱼体氧化应激模型 以新鲜鱼油为对照组和四种不同氧化程度的鱼油（过氧化值为 100、200、300和400 meq/kg）为脂肪源;配制5种饲料饲喂洛氏鱥8w;分别在4w和8w取样检测生长及抗氧化相关指标筛选建立洛氏鱥幼鱼轻度及重度氧化应激模型条件。结果表明;与对照组（新鲜鱼油组）相比;氧化鱼油显著影响洛氏鱥的生长及饲料利用;且随着鱼油氧化程度加深;洛氏鱥平均增重率、特定生长率、摄食率、饲料效率、蛋白质效率呈下降趋势(P<0.05)。摄食氧化鱼油后;洛氏鱥肝胰脏、肠道和肌肉T-AOC水平、T-SOD活性、CAT活性、GSH含量及GSH-PX活性均显著下降;且下降程度与鱼油氧化程度呈正相关;且MDA水平显著上升(P <0.05)。但在养殖4w时;T-AOC水平、T-SOD活性、CAT活性、GSH含量及 GSH-PX 活性变化趋势不同;存在差异。进一步分析洛氏鱥肝胰脏 Keap1、Nrf2、Maf和HO-1基因mRNA相对表达水平;Keap1基因mRNA相对表达水平显著上调(P<0.05);且随着鱼油氧化程度加深而升高。养殖4w时;Nrf2、Maf和 HO-1 基因 mRNA 相对表达水平随着鱼油氧化程度加深均呈上升趋势;在OFO400 组表达水平最高(P <0.05);但随着养殖时间增加;8w 时各氧化鱼油组Nrf2、Maf和HO-1基因mRNA相对表达水平均显著下降(P<0.05)。综合洛氏鱥生长、抗氧化酶及抗氧化相关基因表达指标;在本试验条件下;过氧化值为100和400 meq/kg 的鱼油饲喂洛氏鱥8w能分别成功诱导轻度和重度氧化应激。 (4) L-肉碱对氧化应激洛氏鱥幼鱼保护效果评价 为验证 L-肉碱对氧化应激洛氏鱥抗氧化功能的调节作用;根据试验三的结果选取轻度（POV 100 meq/kg）和重度（POV 400 meq/kg）鱼油饲喂洛氏鱥;同时分别在这两种氧化鱼油饲料中分别添加500mg/kg和1000mg/kg两个水平的L-肉碱;同时设置新鲜鱼油组为对照组;共7个试验组：对照组（新鲜鱼油组）、轻度氧化鱼油组（POV 100 meq/kg）、重度氧化鱼油组、轻度氧化鱼油组（POV 100 meq/kg）+L-肉碱（500mg/kg）组、轻度氧化鱼油组（POV 100 meq/kg）+L-肉碱（1000mg/kg）组、重度氧化鱼油组（POV 100 meq/kg）+L-肉碱（500mg/kg）组、重度氧化鱼油组（POV 100 meq/kg）+L-肉碱（500mg/kg）组;来评价L-肉碱的抗氧化作用。本试验条件下;与对照组相比;氧化鱼油显著影响洛氏鱥的生长及饲料利用;洛氏鱥平均增重率、特定生长率、摄食率、饲料效率、蛋白质效率呈下降趋势(P<0.05);但添加L-肉碱后;能显著回调平均增重率、特定生长率、摄食率、饲料效率、蛋白质效率(P<0.05);且回调能力有L-肉碱添加量有关。摄食氧化鱼油后;洛氏鱥肝胰脏、肠道和肌肉T-AOC水平、T-SOD活性、CAT活性、GSH含量及GSH-PX活性均显著下降(P <0.05);且下降程度与鱼油氧化程度呈正相关;且MDA水平显著上升。但添加L-肉碱后;能显著回调T-AOC水平、T-SOD活性、CAT活性、GSH含量及GSH-PX活性;降低MDA水平(P<0.05)。进一步分析Keap1、Nrf2、Maf和HO-1基因mRNA相对表达水平;发现氧化鱼油可通过上调Keap1基因表达下调Nrf2的表达;进而下调Maf及HO-1基因表达(P<0.05);洛氏鱥机体抗氧化水平下降;L-肉碱则能抑制Keap1基因表达激活Nrf2;调动下游靶基因表达;增强洛氏鱥机体抗氧化功能;缓解氧化鱼油对洛氏鱥造成的毒性损伤。 综合试验结果可知;H2O2暴露对FHM细胞产生毒性以及饲料中鱼油氧化危害洛氏鱥幼鱼生长;体外和体内试验结果共同证明了在氧化应激条件下 L-肉碱能通过激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路降低FHM细胞和洛氏鱥毒性;改善FHM细胞和洛氏鱥的抗氧化能力;对其具有明显的保护作用。

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