五株神经致幻型毒菌的初步鉴定及其活性成分研究

摘要

神经致幻型毒菌又称迷幻菇，这是一类在其子实体或菌丝体中含有致幻型毒素活性色胺类物质，能够引起人或者其他动物致幻型中毒的大型真菌。活性色胺类物质的结构特点是其分子结构中含有吲哚环和二甲基氨基基团，包括裸盖菇素和脱磷裸盖菇素等。神经致幻型毒菌在世界各地广泛分布，种类很多，包括裸盖菇属、花褶伞属、裸伞属、球盖菇属、丝盖伞属、锥盖伞属、鹅膏属、垂幕菇属、光柄菇属、田头菇属等属的一些种类。
　　 神经致幻型毒菌及其所含有的毒素可以引起人或者其他动物神经兴奋，可使心跳加快、呼吸频率增加、收缩压上升、体温升高、脸面潮红、出汗、发冷、瞳孔放大等症状；引起异常精神状态，有陌生感、思维比较困难、兴奋以及五官和肢体感觉异常，甚至出现幻觉。在一些西方国家，有些年轻人因为滥用迷幻菇或是其毒性成分，给社会带来了一定的危害，使这类毒菌的吸食和研究遭到了很大的限制。但是这类毒菌或其所含有的活性成分在治疗精神疾病、恐惧症、神经失调、戒除烟酒、头痛和研究大脑奥秘等方面具有积极作用，所以西方国家学者们并没有间断对它们的研究。研究的主要内容包括致幻型毒菌的生境调查和种的鉴定，活性成分的提取、检测、分离纯化、结构鉴定，代谢与分泌、合成以及在精神疾病方面的诊断和治疗等。而我国对这一领域的研究相对落后，仅进行了简单的生境调查和毒菌生物学特性研究，对其毒素成分的合成以及应用方面的研究尚未进行。
　　 本文以采集于不同地点的五个菌株为实验材料。利用光镜技术、分子生物学技术、高效液相色谱技术、质谱技术、核磁共振技术，对这五个菌株进行了分类鉴定和活性成分分析。主要内容包括：这五个菌株的生态学和组织学特征，ITS序列测定，菌种分离和菌丝培养条件的优化选择，毒素的试纸及TLC检测，对昆明小白鼠的毒性研究，活性成分的HPLC分离分析和结构鉴定，研究结果如下：
　　 1.测定了这五个菌株的18SrDNA(部分)-ITS1-5.8SrDNA-ITS2-28SrDNA(部分)序列，并与基因库中的序列进行比对分析。表明ITS区DNA序列分析可将菌株鉴定至属。其中443-菌株、518-菌株和宁乡采集菌株为裸盖菇属种类，581-菌株和汨罗采集菌株为盔孢伞属种类。但要鉴定至种，还需进一步进行多相分类。
　　 2.通过光学显微镜、荧光显微镜对这五个菌株进行形态组织学方面的观察。443、518和宁乡菌株形态结构一样，担子棒状，四孢，孢子椭圆形，褐色，萌发孔明显，褶缘囊状体发达，双核菌丝，锁状联合常见。根据宏观形态、显微特征以及ITS序列可以确定443-菌株、518-菌株和宁乡菌株为裸盖伞属苏湄岛菇(Psilocybe samuiensis)。
　　 3.通过组织分离获得了苏湄岛菇的菌种。并从基本培养基、麦芽汁培养基和牛粪汁培养基这三种培养基中筛选出了液体培养菌丝体最优培养基为牛粪汁培养基。
　　 4.通过试纸的初步检测和TLC法从粗毒提取液中分离得到紫褐色斑点(Rf=0.16)，初步证明含有裸盖菇素，说明这五个菌株均属于神经致幻型毒菌。利用小白鼠腹腔注射，测定了苏湄岛菇子实体粗毒液的毒性，表明该毒菌可以引起小鼠兴奋，中毒症状和所施用药剂量呈正比关系。在设定的粗毒液实验浓度内，小鼠并没有发生死亡现象，表明致幻型毒菌的毒性较低。
　　 5.运用HPLC技术分离苏湄岛菌丝体中的活性成分，得到了4个组分，将它们分别收集，冻干后利用质谱和核磁共振技术对其中的活性成分进行了结构鉴定。得到了一种嘧啶核苷类化合物，是其中重要的活性成分之一。另外3个组分还在谱图解析中。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1神经致幻型毒菌认识和利用简史

1.2神经致幻型毒菌的种类和分布

1.3神经致幻型毒素

1.3.1毒素的种类

1.3.2毒素的结构和性质

1.3.3中毒临床症状表现

1.3.4中毒机理

1.3.5中毒治疗和预防

1.3.6毒素的提取和检测

1.4致幻型毒菌及毒素的应用

1.4.1诊断和治疗精神疾病

1.4.2探讨大脑奥秘

1.4.3帮助吸毒者戒毒

1.4.4辅助心理治疗

1.4.5对健康人群的有利作用

1.4.6在其它方面的应用

1.5真菌的分类研究

1.6本研究的目的和意义

2基于ITS的菌株鉴定和分析

2.1材料、试剂与仪器

2.1.1实验材料

2.1.2试剂

2.1.3仪器设备

2.2实验方法

2.2.1菌丝体培养

2.2.2基因组DNA的提取

2.2.3 PCR扩增

2.2.4 PCR产物的凝胶回收纯化

2.3结果与分析

2.3.1 DNA提取、PCR扩增及产物纯化

2.3.2　DNA序列测定

2.3.3 DNA序列数据分析

2.4讨论

3经典分类学方法的菌种鉴定

3.1材料、试剂与仪器

3.1.1实验材料

3.1.2供试培养基

3.1.3试剂

3.1.4仪器

3.2实验方法

3.2.1子实体形态和生态特征研究

3.2.2菌丝体制样及染色

3.3结果与分析

3.3.1供试菌株的形态特征

3.3.2供试菌株的生态特征

3.4讨论

4苏湄岛菇活性成分的初步研究

4.1材料、试剂与仪器

4.1.1供试样品

4.1.2培养基

4.1.3试剂

4.1.4仪器

4.2实验方法

4.2.1液体培养基的优化选择

4.2.2活性色胺类物质的提取

4.2.3毒素的试纸检测

4.2.4毒素的TLC检测

4.2.5粗毒的毒性实验

4.2.6脱脂粗毒的分离纯化

4.2.7质谱分析

4.2.8核磁共振分析

4.3结果与分析

4.3.1液体培养基的优化选择

4.3.2毒素的试纸和TLC检测

4.3.3粗毒的毒性实验

4.3.4苏湄岛菇中主要活性成分的分离纯化

4.3.5苏湄岛菇中主要活性成分的结构鉴定

4.4 讨论

参考文献

图版

附录 附：硕士期间发表的文章

致谢