产高光学纯度D-乳酸保加利亚乳杆菌工程菌的构建及在生物炼制中的应用

摘要

D-乳酸是一种广泛应用于食品、化工、环保、医药等领域的重要合成中间体。随着聚乳酸行业的兴起，D-乳酸需求量逐年增加，当前 D-乳酸的工业化生产主要采用化学合成法。但此方法具有污染高，光学纯度低，容易产生消旋体（D/L-乳酸）的弊端，不适应可持续发展的要求。利用微生物发酵产 D-乳酸，具有无污染，D-乳酸的光学纯度高的特点，相对于化学合成法具有明显的优势。但采用微生物发酵法生产 D-乳酸有两个瓶颈问题：①成本高：微生物发酵过程中，菌体通常对发酵底物的营养需求较高，导致 D-乳酸的生产成本上升;②生产效率较低：天然存在具有产 D-乳酸能力的菌株较多，例如乳酸菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。但野生型菌株的产量较低，远不能满足工业化生产的要求。为解决微生物发酵产 D-乳酸面临的两个主要问题，本研究对德氏乳杆菌保加利亚亚种进行代谢途径改造，敲除乙酸代谢途径和 L-乳酸代谢途径，构建一株高产高光学纯度D-乳酸的工程菌;为进一步降低微生物发酵产D-乳酸的成本，采用来源丰富的木质纤维素资源—玉米秸秆替代葡萄糖作为发酵底物。利用新型催化剂-固体酸对玉米秸秆进行预处理，研究固体酸预处理玉米秸秆的最佳工艺，将预处理的玉米秸秆应用于产D-乳酸的工程菌同步糖化发酵D-乳酸的研究中，实现玉米秸秆转化为高附加值D-乳酸的目的。主要研究结果如下： 1. 德式乳杆菌保加利亚亚种CICC 21101最适生长条件：温度37℃，pH值为6.0，转速120 rpm;最适产酸条件：温度42℃，接种量5%，初始葡萄糖浓度5%，在最适发酵条件下，菌株D-乳酸产量为35 g/L，光学纯度为87.5%e.e。 2. 对野生型德式乳杆菌保加利亚亚种进行代谢途径改造，利用乳酸菌专用敲除质粒pGHost 4，对德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC 21101 L-乳酸代谢途径和乙酸代谢途径中的关键酶基因L-乳酸脱氢酶基因（ldb0094、ldb0120）、乙酸激酶基因（ack）进行敲除。（1）乙酸激酶基因的敲除：利用本实验室已构建的乙酸激酶基因敲除质粒 pGhost-△ack 电转化德式乳杆菌保加利亚亚种感受态细胞中，筛选阳性克隆，利用敲除引物pGhost4-Δack-L-F/pGhost4-Δack-R-R PCR进行验证，结果显示乙酸激酶基因成功被敲除，通过高效液相（HPLC）测定工程菌（DS-A）发酵液D-乳酸产量和光学纯度，D-乳酸产量达到35 g/L，光学纯度为90%e.e。（2）L-乳酸脱氢酶基因（ldb0094、ldb0120）的敲除：选取L-乳酸脱氢酶基因（ldb0094、ldb0120）上下游片段，利用重叠PCR对上下游片段进行拼接，构建L-乳酸脱氢酶基因敲除质粒pGhost-△ldh1/pGhost-△ldh2，电转化德式乳杆菌保加利亚亚种（DS-A）感受态细胞中，筛选阳性克隆，并对其基因和发酵产物进行验证，PCR 验证结果显示 L-乳酸脱氢酶基因成功被敲除;高效液相测定结果显示，敲除 L-乳酸脱氢酶基因（ldb0094），工程菌（DS-L1）发酵液中L-乳酸产量和光学纯度明显上升，产量达到29.8 g/L，光学纯度为93.5%e.e， D-乳酸产量和光学纯度明显下降，产量为 2.6 g/L;敲除 L-乳酸脱氢酶基因（ldb0120），工程菌（DS-L2）D-乳酸产量和光学纯度明显上升，最终 D-乳酸产量高达41 g/L，光学纯度为99.5%e.e。 3. 以粉碎的玉米秸秆为原料，以固体酸为预处理剂，研究其预处理玉米秸秆的最佳工艺，通过单因素和正交实验得到固体酸预处理玉米秸秆最佳工艺：温度120℃、固体酸浓度1.5%、时间80 min、纤维素酶添加量30 FPU/g纤维素，最终转化率为71.06%。利用扫描电镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶红外光谱（FTIR）对预处理玉米秸秆的结构变化进行测定，扫描电镜测定结果显示固体酸预处理使得玉米秸秆表面由原来光滑规则有序的结构变得粗糙杂乱，产生了大量孔洞;X射线衍射结果表明预处理后玉米秸秆结晶度有所下降，结晶区发生重结晶现象;傅里叶红外光谱结果显示半纤维素和木质素的吸收峰减弱，纤维素吸收峰增强。SEM、XRD、FTIR结果证明了固体酸预处理玉米秸秆具有良好的效果。 4. 研究了利用预处理后的玉米秸秆替代葡萄糖添加物作为发酵底物时，德式乳杆菌保加利亚亚种CICC 21101和德式乳杆菌保加利亚亚种CICC 21101工程菌DS-L2同步糖化共发酵产D-乳酸的情况，结果显示在MRS+秸秆发酵培养基中秸秆添加量为10%时，D-乳酸的产量达到最高，原菌最高产量为51 g/L，工程菌DS-L2的最高产量为61 g/L，在以秸秆为唯一发酵碳源时，野生型菌株D-乳酸产量为18 g/L，光学纯度为87.5%e.e，工程菌DS-L2的D-乳酸产量为21 g/L，光学纯度为99.8%e.e。

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