发光细菌的分离鉴定以及用于环境毒性检测的系统研究

摘要

本实验从家乐福超市冻猪肉上分离、纯化得到一株发光细菌。通过对该株发光细菌的相关生理生化检测、光谱检测、菌体形态观察，以及对其16SrDNA、gyrB、luxA三个基因的扩增与测序等试验进行了种属鉴定。参照《伯杰细菌鉴定手册》对比得出该分离纯化得到的发光细菌与其中的发光杆菌属(PhotobacteriumBeijerinck1889，401)的特征描述一致。对gyrB、luxA这两个基因的测序序列进行了比对并分别构建发育树进行分析，最终确定此细菌为发光杆菌属(Photobacterium)的明亮发光杆菌(Photobacteriumphosphoreum)。通过gyrB、luxA基因系统发育分析，发现该菌株(编号：PB-P3.9)与标准菌株P.phosphoreumNCIMB1279亲缘关系最近，后者是与深海鱼类(长尾鳕科鱼类和后肛鲑科鱼类)共生的一种发光细菌，或者寄生于中层海水水域的浮游生物内。说明发光细菌PB-P3.9来自海洋。
　　 发光细菌法在环境毒性检测中是一种快速、灵敏、低成本的生物检测方法，受到人们广泛的重视。但所使用的发光细菌种类有限，我国常用的3种发光细菌为：明亮发光杆菌T3、费氏弧菌、青海弧菌Q67。本实验对发光细菌PB-P3.9应用于环境毒性检测的可行性进行了系统研究。应用培养菌液检测实际水体样品，同时对水体样品进行镜检，实验结果显示检测的四种水体水质结果与传统的指示生物法所测结果一致。培养菌液对两种重金属化合物的检测结果均呈现良好的线性关系，所检测两种重金属的毒性大小(EC50)比较结果与以往文献报道结果一致。随后制备该发光细菌的冻干粉，并应用冻干粉复苏菌悬液检测两种重金属化合物的急性毒性，检测结果均呈现良好的线性关系。与培养菌液检测相比，其检测灵敏度有所提高。
　　 该研究主要开展的工作为：
　　 1.猪肉发光细菌的分离与鉴定。从冻猪肉上分离、纯化得一株发光细菌，通过对这株发光细菌的相关生理生化指标以及相关基因的扩增与测序分析，完成了系统鉴定；并确定了发光猪肉产生的原因以及该株发光细菌的来源。
　　 2.应用纯化的发光细菌实现环境毒性快速检测分析。用该发光细菌的培养菌液检测四处实际水体样品，同时对水体样品进行镜检，初步判定这四处水体的水质情况。该培养菌液还检测了氯化汞和氯化镉两种重金属化合物的急性毒性。通过对环境中实际水样的检测与对重金属化合物的毒性检测分析，发现该株发光细菌具有较大的利用开发前景。
　　 3.发光细菌冻干粉制备和应用。确定了制作冻干粉过程中保护剂和菌体培养条件的优化。对冻干粉的复苏效果进行检测，发现复苏菌悬液发光稳定，复苏效果较好。应用冻干粉对重金属化合物毒性进行检测，实验分析发现，与培养菌液检测相比，其检测灵敏度有所提高，且冻干粉易储存和运输，应用方便、快捷，说明该株发光细菌在环境毒性检测中具有很大的应用前景。