氧化还原蛋白质的直接电化学及棋模拟物在抗氧化分析中的应用

摘要

氧化还原蛋白质在电极表面的直接电化学研究是生物电化学领域和生命科学领域非常热点的研究问题。它的研究对于人们获得蛋白质的热力学和动力学性质,深入认识蛋白质和酶等生物大分子在生命体内的生理作用及电子传递反应、传递机制以及开发新型的生物传感器、新型的生物燃料电池等生物电子器件都具有重要的理论和实际指导意义。另一方面,抗氧化剂被证明是很有效的自由基清除剂,并且在阻止自由基对人体的损伤方面起着重要作用,因此研究抗氧化剂的自由基清除过程和抗氧化能力也显得尤为重要。基于上述情况,本论文开展了若干研究工作,具体内容如下:
　　 1.设计了一种新型的基于氨基酸离子液体(AAILs)和碳纳米管(CNTs)复合物的电化学传感界面。其中,氨基酸离子液体被用作一种新型的葡萄糖氧化酶(GOD)溶剂。通过将碳纳米管修饰的玻碳(GC)电极浸泡在含有葡萄糖氧化酶的氨基酸离子液体溶液中,就可以方便的获得GOD-AAILs/CNTs/GC电极。用循环伏安法研究葡萄糖氧化酶在GOD-AAILs/CNTs/GC电极上的直接电化学,获得了一对可逆的氧化还原峰。同时固定在电极上的葡萄糖氧化酶仍然保持了它们的生物活性以及催化溶解氧还原的能力。在氨基酸离子液体和碳纳米管的协同作用下,该GOD-AAILs/CNTs/GC电极展现了对葡萄糖良好的电催化活性,其检测线性范围为0.05-0.8 mmol/L,检测限为5.5μmol/L(S/N=3)。并且该传感器显示了良好的稳定性以及排除常见共存物尿酸和抗坏血酸干扰的能力。
　　 2.基于带正电的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)包裹的金纳米棒(AuNRs)与带负电的超氧化物歧化酶(SOD)在半胱氨酸(Cys)修饰金电极上的层层自组装,开发了一种检测超氧自由基(O2·-)的第三代生物传感器((SOD/AuNRs)2/Cys/Au电极)。SOD在电极表面的直接电子转移以及其本身双功能化的催化活性为O2·-的检测提供了阳极检测和阴极检测两种途径。无论是在氧化电位还是还原电位下(SOD/AuNRs)2/Cys/Au电极都显示出了良好的分析性能,如宽的检测范围,低的检测限,快的响应时间以及良好的稳定性及重现性。
　　 3.开发了一种新型、简单、比色的基于DNA酶的抗氧化剂自由基清除能力检测方法。在这个新的策略中,DNA酶作为辣根过氧化物酶(HRP)的模拟物催化H2O2氧化2,2'-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS2-)产生蓝绿色的ABTS·-自由基。而ABTS·-自由基又能够被抗氧化剂清除并导致颜色的变化。典型的抗氧化剂抑制的ABTS·-产生动力学曲线分为两个截然不同的阶段:平台期(阶段Ⅰ)和线性增长期(阶段Ⅱ)。我们利用平台期时间t和线性增长期直线斜率k的乘积kt值作为抗氧化能力测定的参数。这个基于DNA酶的抗氧化剂检测体系被成功的应用到了对抗氧化剂浓度的定量检测以及不同抗氧化剂和实际样品的抗氧化能力的评估。

目录

文摘

英文文摘

第1章 绪论

1.1 氧化还原蛋白质及酶的电化学研究

1.1.1 研究背景

1.1.2 氧化还原蛋白质的间接电化学

1.1.3 氧化还原蛋白质的直接电化学

1.2 葡萄糖生物传感器

1.2.1 葡萄糖电化学传感器的发展过程

1.2.2 葡萄糖电化学传感器机理

1.3 基于超氧化物歧化酶(SOD)的超氧自由基生物传感器

1.3.1 构建超氧自由基(O2·-)传感器的意义

1.3.2 O2·-的测定方法

1.3.3 超氧化物歧化酶电化学生物传感器

1.4 过氧化物酶及其脱氧核酶模拟物

1.4.1 脱氧核酶

1.4.2 脱氧核酸过氧化物酶模拟物

1.5 抗氧化剂与抗氧化活性的检测方法

1.5.1 检测抗氧化剂的意义

1.5.2 抗氧化剂的定义及其分类

1.5.3 抗氧化剂抗氧化能力的测试方法

1.6 本文构思

第2章 氨基酸离子液体与碳纳米管协同作用下的葡萄糖氧化酶直接电化学

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 实验仪器与试剂

2.2.2 氨基酸离子液体的合成和表征

2.2.3 制作GOD-AAILs/CNTs修饰的玻碳电极(GOD-AAILs/CNTs/GC)

2.3 结果与讨论

2.3.1 通过[Fe(CN)6]3-/4-的氧化还原探针来表征GOD-AAILs/CNTs/GC电极的组装过程

2.3.2 GOD-AAILs/CNTs/GC的循环伏安曲线

2.3.3 傅立叶变换红外光谱(FTIR)和紫外可见光谱(UV-Vis)

2.3.4 pH值对于GOD的直接电子转移的影响

2.3.5 GOD-AAILs/CNTs/GC电极的电催化行为

2.3.6 传感器的再现性和稳定性

2.4 本章小结

第3章 基于金纳米棒和超氧化物歧化酶层层自组装的超氧自由基生物传感器

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 仪器和测量

3.2.2 试剂和材料

3.2.3 制备CTAB包裹的金纳米棒

3.2.4 制备(SOD/AuNRs)n/Cys/Au电极

3.3 结果和讨论

3.3.1 金纳米棒的紫外可见光谱和透射电镜表征

3.3.2 SOD在(SOD/AuNRs)n/Cys/Au电极上的直接电化学

3.3.3 pH值对于SOD直接电化学的影响

3.3.4 检测超氧自由基(O2·-)

3.3.5 线形范围、检测限以及重现性

3.3.6 抗干扰能力

3.4 本章小结

第4章 开发一种基于G-四聚体DNA酶的新型抗氧化分析技术

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验仪器与试剂

4.2.2 基于DNA酶分析方法的比色测量

4.2.3 不同浓度DNA酶的比色测量

4.2.4 抗氧化剂、饮料和血样的比色测量

4.2.5 DNA-hemin相互作用的光谱学研究

4.2.6 研究温度对于DNA酶和Mb的催化活性的影响

4.3 结果和讨论

4.3.1 基于DNA酶的分析方法用于抗氧化能力的检测

4.3.2 优化用于抗氧化能力检测的DNA酶体系

4.3.3 基于DNA酶的方法定量检测抗氧化剂浓度

4.3.4 通过基于DNA酶的方法测定抗氧化剂相对抗氧化能力

4.3.5 研究抗氧化剂对于DNA和hemin结合的影响

4.3.6 基于DNA酶的方法与之前报道的基于蛋白质的方法之间的比较

4.4 本章小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢