基于新型微型PCR芯片的电化学检测方法研究

摘要

由于生物芯片拥有微型化、便携式、灵敏度高、成本低等优势,从而吸引了科研工作者的广泛关注。微型聚合酶链式反应(PCR)芯片作为生物芯片的一种,它将传统PCR温度扩增和PCR产物检测集成到一个功能齐备的芯片上,来实现芯片实验室(Lab-On-a-Chip),加之PCR技术在生物化学检测领域中有着不可撼动的地位,因此对PCR仪器微型化、便携式、市场化的要求越来越高,而微型PCR芯片是实现该需求很有前景的一种形式。本文采用微机电系统(MEMS)工艺制备微电极阵列芯片和静态实时定量PCR阵列芯片,对三模块微型智能定量PCR系统和静态实时定量微型PCR系统分别进行组装,之后对微型PCR芯片的生物化学环境适应性、表面清洗以及60nl微反应仓的密封问题进行了系统研究,并针对微型PCR芯片中的微电极在电化学检测领域中的应用,特别是PCR产物检测,提出了一种新型的无标记PCR产物电化学检测方法。本论文的主要内容包括如下几个方面:
　　 在第二章,以微型PCR芯片设计为基础,采用MEMS工艺,通过不同工艺流水过程分别实现了形貌标准的微电极阵列芯片和静态实时定量微型PCR功能单元阵列芯片,并对其进行了较为深入的生物化学环境适应性研究,为利用MEMS技术制备生物芯片提供了新的依据与建议。同时实现了两个系统的集成组装,包括温度控制模块、生物化学检测模块与数据显示模块的集成。
　　 在第三章,对第二章中实现的静态实时定量PCR芯片的单个功能单元微反应仓材料和仓盖材料的选择进行研究,最终选用疏水性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)透明膜作为仓盖,并通过亚甲基蓝指示剂对体积为60nl的微反应仓密封性进行效果量化研究,结果显示,在57℃以下,微反应仓密封效果佳。此实验结果为后续实验的进行提供了保证,并为后续实验结果的可靠性提供了重要依据。
　　 在第四章,用第二章中实现的微电极阵列芯片对甲醛、甲醇、乙醇三种常见有机物的水溶液进行电化学特异性检测,结果显示,三者在不同电压出现特异性峰,并在混合液中也呈现出特异性现象。针对第二章中实现的静态实时定量PCR芯片提出了一种利用微电极的无标记电化学沉积脱氧核糖核酸(DNA)的PCR产物检测方法,该方法基于微电极本身的高灵敏度以及PCR在20循环以内错配率可以忽略,而20循环以上可以量化的原理,利用双链DNA的电负性,采用正负电荷吸引的原理,将双链DNA沉积到工作电极表面,然后通过电化学工作站进行检测,结果显示,该方法应用于PCR产物检测具有可行性。
　　 在第五章,在第二章实现的静态实时定量PCR芯片基础上,探索PCR基因扩增三温度循环与实时检测的可行性。并对目前存在的问题,在密封与微加热器两个方面进行了深入的讨论,对实验中遇到的阻碍提出了建设性意见。

目录

文摘

英文文摘

第1章 绪论

1.1 生物芯片

1.2 聚合酶链式反应

1.2.1 聚合酶链式反应概论

1.2.2 PCR技术发展

1.2.3 传统标准PCR反应

1.2.4 PCR基因扩增的特点

1.2.5 PCR扩增产物分析

1.3 PCR基因扩增分析仪的发展

1.4 微机电系统技术

1.4.1 微机电系统基本概念

1.4.2 微机电系统基本工艺

1.4.3 微机电系统应用领域与研究进展

1.5 微型PCR芯片

1.5.1 微型PCR芯片类型

1.5.2 微型PCR芯片产物检测

1.6 选题依据及研究内容

1.6.1 选题依据

1.6.2 研究内容

第2章 微型PCR系统及芯片制备工艺

2.1 三模块微型智能定量PCR系统

2.1.1 实验仪器

2.1.2 实验材料

2.1.3 微电极阵列芯片工艺流程

2.1.4 微电极阵列芯片实验结果

2.1.5 三模块微型智能定量PCR系统组装

2.2 静态实时定量PCR系统

2.2.1 实验仪器

2.2.2 实验材料

2.2.3 静态实时定量微型PCR芯片工艺流程

2.2.4 静态实时定量微型PCR芯片实验结果

2.2.5 静态实时定量微型PCR系统组装

2.3 微型芯片生物化学环境适应性研究

2.3.1 导线材料的选择问题

2.3.2 聚二甲基硅氧烷仓、盖及其保护

2.3.3 芯片表面清洗与表面处理

2.3.4 微型芯片生物化学环境适应性研究结果与讨论

2.4 本章小结

第3章 微反应仓制备与密封研究

3.1 微反应仓概述

3.2 亚甲基蓝原理

3.3 微反应仓密封方法设计

3.4 微反应仓制备与密封实验

3.4.1 实验仪器

3.4.2 实验材料

3.4.3 仓盖材料选择

3.4.4 微反应仓与仓盖制备

3.4.5 基于间接测试的微反应仓密封试验

3.4.6 反应仓加热试验

3.5 微反应仓制备与密封实验结果与讨论

3.5.1 反应仓密封试验结果分析

3.5.2 反应仓加热试验结果分析

3.6 本章小结

第4章 基于微电极系统的生物化学检测研究

4.1 微电极阵列芯片检测方法分析

4.1.1 实验仪器

4.1.2 实验材料

4.1.3 微电极阵列芯片检测实验

4.1.4 微电极阵列芯片检测实验结果与分析

4.2 静态实时定量PCR芯片电化学检测的测试与应用

4.2.1 实验仪器

4.2.2 实验材料

4.2.3 DNA固定验证实验

4.2.4 DNA固定验证实验结果与讨论

4.2.5 PCR产物制备与检测

4.2.6 PCR产物制备及检测实验结果与分析

4.3 本章小结

第5章 基于微型PCR芯片的基因扩增与实时检测

5.1 实验仪器

5.2 实验材料

5.3 PCR基因扩增与实时检测实验

5.4 PCR基因扩增与实时检测实验结果与讨论

5.4.1 PCR基因扩增与实时检测实验结果

5.4.2 PCR基因扩增与实时检测实验结果讨论

5.4.3 实验建议

5.5 本章小结

结论与展望

参考文献

附录A 攻读学位期间发表及待发表的学术论文目录

附录B 攻读学位期间申请的专利及参与的课题

致谢