转录因子FoxA1对干细胞多能性基因Nanog的转录调控研究

摘要

胚胎干细胞具有在体外自我更新和分化成所有三胚层来源的细胞的能力。广义上的胚胎干细胞包括：一.从机体幼稚生殖细胞发生癌变形成的恶性畸胎瘤建立的胚胎癌细胞（embryonal carcinoma cell，EC细胞）；二.从囊胚的内细胞团建立的胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）；三.从胚胎性腺区的原始生殖细胞建立的胚胎生殖细胞（embryonic germ cell，EG细胞）。胚胎干细胞的多能性主要依靠以Oct4，Nanog，Sox2为核心的转录因子网络来维持。
　　本文主要以P19胚胎癌细胞（EC细胞）为模型，研究干细胞在维甲酸（retinoic acid, RA）诱导的分化过程中的基因表达调控机制。P19细胞具有多能性，注射到囊胚期胚胎中能形成嵌合体动物、注射到裸鼠皮下能形成具有三胚层结构的畸胎瘤；在体外，能被诱导分化成胚胎所有三胚层来源的细胞。因此，P19细胞是研究多能干细胞分化调控机制的良好模型。
　　本文着重研究转录因子FoxA1在干细胞分化过程中的转录调控机制。FoxA1是Forkhead Box转录因子家族的一员，参与胚胎发育中细胞增殖与分化的调节。由于能够结合高度压缩的染色质，并引导其它转录因子与染色质的结合，FoxA1被称为“先锋”转录因子。过去的研究发现，在RA诱导的P19细胞分化过程中，FoxA1表达迅速被激活；多能性相关基因表达迅速下降，如Nanog；而分化相关基因表达依次被激活，如早期神经发生相关基因Shh，神经干细胞标志物Nestin。进一步的研究发现，FoxA1直接激活了Shh的表达；同时发现，在P19细胞中单独过表达FoxA1，可激活Nestin表达，并导致Nanog蛋白水平的下降。本文从表观遗传学角度，探索转录因子FoxA1在RA诱导的干细胞分化过程中对多能性基因Nanog的转录调控，并得到了以下结果：
　　一.检测了RA诱导前后多能性标志基因Nanog的表达水平及表观遗传修饰状态的变化。RA处理P19细胞后， Nanog的mRNA及蛋白水平均迅速下调；同时，我们考察了表观遗传修饰状态包括组蛋白H3乙酰化（H3K9ac）修饰、组蛋白H3K4甲基化(H3K4me2)修饰、组蛋白H3K27(H3K27me3)甲基化修饰和DNA甲基化修饰。研究发现，在未分化状态， Nanog基因的组蛋白修饰状态表现为H3K9高度乙酰化，H3K4高度甲基化，H3K27低甲基化；RA诱导两天后，H3K9被去乙酰化，H3K4甲基化程度降低， H3K27高度甲基化。DNA甲基化方面，在未分化的P19细胞中，Nanog启动子区域呈现低甲基化；RA处理四天后，Nanog启动子区域被高度甲基化。
　　二.发现在RA诱导过程中，FoxA1和Grg3直接结合于Nanog基因的增强子，并抑制Nanog的表达。根据过去的研究结果，猜测FoxA1直接抑制Nanog基因的表达。有文献报道FoxA1可能募集转录辅抑制子Grg3，通过mRNA和蛋白水平检测，发现，在RA诱导前后的P19细胞中，Grg3保持稳定表达。通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验，确认，在RA处理两天时FoxA1与Grg3同时结合于Nanog基因上游-2kb附近区域。此外，在RA处理P19细胞时，分别干扰FoxA1和Grg3的表达，发现RA处理两天后， Nanog仍然维持表达。
　　三.探索了FoxA1抑制Nanog表达的细节分子机制。通过凝胶迁移实验（EMSA）确认FoxA1结合Nanog增强子-2025bp至-2001bp区域，而Grg3单独不能结合DNA；通过免疫共沉淀（Co-IP）与免疫荧光共定位实验，确认了FoxA1与Grg3直接相互作用；通过双荧光素酶活性分析，发现FoxA1与Grg3协同抑制了Nanog启动子的活性。
　　四.发现在P19细胞中单独高表达FoxA1可以改变Nanog基因组蛋白修饰状态，但对Nanog基因启动子区域的DNA甲基化状态影响不大。FoxA1高表达两天后， H3K9被去乙酰化，H3K4甲基化程度降低，H3K27被甲基化。

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第1章 绪 论

1.1 真核生物的基因表达调控

1.2 干细胞概述

1.3 转录因子FoxA1

1.4 本文研究背景及内容

第2章 Nanog在RA诱导的P19细胞分化过程中被沉默

2.1 前言

2.2 实验材料和仪器

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 小结

第3章 FoxA1和Grg3影响Nanog基因表达下调

3.1 前言

3.2 实验材料和仪器

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 小结

第4章 FoxA1募集Grg3并抑制Nanog启动子活性

4.1 前言

4.2 实验材料和仪器

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 小结

第5章 FoxA1表达影响P19细胞中Nanog启动子表观遗传修饰状态

5.1 前言

5.2 实验材料和仪器

5.3 实验方法

5.4 结果与讨论

5.5 小结

结论

参考文献

附录A 常用缓冲液和试剂配方

附录B 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢